Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 27/07/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-291799)
40 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis replacées à l’issue. Chacune reçoit une éponge vaginale posée douze jours, une injection intramusculaire d’hormone puis une prise de sang à la jugulaire, le porteur signalant un stress de contention et un possible hématome. Leur sang sert à préparer du sérum de brebis en œstrus, un composant du milieu de fécondation in vitro d’ovocytes de brebis. Le porteur affirme qu’aucun protocole sans sérum n’est efficace et rattache l’ensemble à des perspectives lointaines de restauration de la fertilité chez la femme.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif est de préparer du sérum de brebis en œstrus, qui est un composant du milieu de fécondation in vitro (FIV) des ovocytes ovins. Cette technologie sera mise en œuvre au laboratoire dans le cadre d’un programme de recherche ne faisant pas appel à d’autres animaux expérimentaux (ovocytes obtenus à partir d’ovaires collectés post-mortem sur des animaux abattus dans des abattoirs commerciaux). Le programme de recherche vise à optimiser la qualité des ovocytes cultivés in vitro par l’addition de facteurs biologiques (notamment des facteurs de croissance ou des hormones) dans le milieu de culture des ovocytes. Après cette étape, la FIV permet de vérifier l’aptitude des ovocytes à être fécondés et à évoluer en embryons, deux indicateurs de leur qualité.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le projet scientifique global contribuera à la mise au point de la culture in vitro des ovocytes de brebis, une espèce qui présente des similarités avec l’espèce humaine (en termes de taille des ovocytes, nombre d’ovulations, chronologie de la croissance des ovocytes dans l’ovaire et du développement des embryons). A court terme, il s’agit d’obtenir, à partir d’ovocytes présents dans l’ovaire mais bien en amont de l’ovulation, des ovocytes fécondables et capables d’évoluer en embryons. Le projet s’insère dans le développement à moyen terme de stratégies de restauration de la fertilité chez la femme : soit en produisant des embryons à partir des ovocytes contenus dans des biopsies ovariennes cryoconservées (conservation qui est proposée aux patientes avant un traitement potentiellement toxique pour les ovocytes), soit en stimulant in vitro la maturation d’ovocytes qui n’ont pas atteint in vivo le stade désiré en dépit d’un traitement de stimulation ovarienne (pour des patientes présentant des troubles de l’ovulation par exemple).
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Après une pose d’éponge vaginale pendant 12 jours suivie d’une injection intramusculaire de PMSG, chaque animal sera soumis à une prise de sang. Chaque opération a une durée inférieure à une minute.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux subiront un stress lié à une contention brève (de l’ordre de la minute) et ressentiront la piqûre de l’aiguille lors de la prise de sang ou de l’injection intramusculaire. La prise de sang peut entraîner un hématome.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront replacés à l’issue de la procédure.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La très grande majorité des protocoles rapportés dans la littérature mentionne l’addition de serum de brebis au moment de la fécondation in vitro ou lors d’une étape précédente dans l’espèce ovine (24/25 références). Une équipe espagnole a publié un protocole sans sérum, mais rapporte un taux de développement embryonnaire le plus faible de l’ensemble des 25 études (12% seulement des ovocytes génèrent des embryons atteignant le stade de blastocystes). A ce jour, il n’y a donc pas d’alternative efficace à l’utilisation de serum pour la production in vitro d’embryons ovins.
2. Réduction
Un prélèvement de de 4 à 5 mL de sang sera réalisée sur deux lots de 20 brebis, pour constituer deux pools de 40 mL de sérum. Il est prévu de pratiquer environ 80 fécondations in vitro sur quatre ans (soit une toutes les deux à trois semaines). Ceci requiert 80 mL de sérum, soit 160 mL de sang. Pour la reproductibilité expérimentale, il faut utiliser le même serum pour chaque série d’expériences, donc limiter le nombre de serums différents sur l’ensemble du projet. Nous prévoyons donc de préparer 2 fois 40 mL de serum, qui sera ensuite aliquoté et congelé. Une variabilité entre individus est observée dans l’efficacité du serum sur la production d’embryons par fécondation in vitro. Pour éviter le risque que le sérum constitué s’avère peu efficace et de ce fait inutilisable, nous faisons le choix – de réaliser les prélèvements sur des animaux du troupeau de l’établissement utilisateur au moment où ils vont être mis à la reproduction. Ils ont en effet reçu dans cette optique un traitement hormonal de synchronisation des chaleurs qui va réduire le nombre d’individus présentant un sérum pauvre en hormones sexuelles et potentiellement peu efficace en fécondation in vitro. – de constituer des pools de sérum à partir de 20 animaux chacun. Ce nombre d’individus représentés dans le pool va limiter la variabilité de la composition du sérum. Remarque 1 : Le prélèvement de 10 mL de sang sur 20 animaux pour constituer un pool unique a été envisagé, mais nécéssiterait une contention plus longue de chaque animal et le prélèvement risquerait d’être plus difficile. Remarque 2 : Le serum collecté peut se conserver plusieurs années au congélateur ; il pourra donc être utilisé même en cas de retard dans l’avancée du programme de recherche.
3. Raffinement
Les brebis seront dans leurs conditions d’élevage habituelles dans un bâtiment d’élevage conventionnel, en case collective à clairvoies sur litière paillée. La pose d’éponge, l’injection intramusculaire et le prélèvement de sang se feront en présence de congénères pour éviter le stress dû à l’isolement. La contention des brebis pour le prélèvement sanguin se fera dans un espace réduit entre des claies. Les opérations, et particulièrement le prélèvement de sang par ponction à la veine jugulaire, seront réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. La présence récurrente des expérimentateurs en interaction positive en dehors de la procédure (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du stress face à la contention. L’animal sera récompensé par des granulés. Lors de la prise de sang, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général (pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité) ; il ne sera pas fait d’anesthésie locale qui s’avèrerait plus douloureuse que la prise de sang, et augmenterait le risque d’hématome. Un baume végétal aux propriétés décongestionnantes, antiseptiques et cicatrisantes sera appliqué en massage sur la veine pour prévenir la douleur post-procédure et une infection éventuelle. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera ensuite assurée dans le cadre du suivi de la mise à la reproduction. En cas de signes de maladie, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil de l’installation expérimentale.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le sang est collecté sur des brebis en vue de préparer du sérum pour la mise en œuvre de la fécondation in vitro d’ovocytes dans cette espèce. Afin de collecter le sang de brebis en oestrus, le prélèvement sanguin sera réalisée sur des brebis adultes de l’élevage de l’établissement au moment de leur mise à la reproduction.