Production d’anticorps polyclonaux murins

Les microsporidies sont des champignons se développant dans les cellules de leur hôte. Chez l’Homme, elles peuvent causer divers syndromes, dont notamment des troubles digestifs responsables de diarrhées aqueuses profuses, qui évolueront vers la chronicité voire la mort chez les sujets ayant un système immunitaire affaibli. La contamination se fait essentiellement par voie orale lors de l’ingestion d’eau ou d’aliments souillés par des microsporidies. Les quantités de microsporidies dans les prélèvements, en particulier environnementaux (aliments, stations d’épuration), sont souvent faibles ce qui est problématique pour les études épidémiologiques. Nous souhaitons développer une méthode d’enrichissement/purification par l’utilisation de billes magnétiques recouvertes d’anticorps dirigés contre des protéines présentes à la surface des microsporidies. Ainsi les anticorps permettront la capture des microsporidies, puis par l’intermédiaire d’un aimant, les billes magnétiques préalablement fixées aux anticorps seront récupérées, permettant ainsi la purification des microsporidies. Pour mener ce projet, nous avons donc besoin de produire des anticorps dirigés contre les microsporidies. Des protéines de surface des microsporidies ont été reproduites en amont, elles seront injectées à des souris, qui vont alors s’immuniser contre ces protéines étrangères. En effet, des anticorps sont produits par le système immunitaire des animaux vertébrés en réponse à l’entrée d’un antigène dans l’organisme de l’animal. Ils sont libérés dans le sang de l’animal à partir duquel ils sont facilement purifiables pour obtenir des anticorps dits polyclonaux, c’est-à-dire un mélange d’anticorps dirigés contre plusieurs fractions de la protéine d’intérêt. La production d’anticorps polyclonaux implique donc l’injection répétée de la protéine d’intérêt à un animal, puis la récupération de la totalité du sang lors du sacrifice de l’animal. Ce projet d’une durée de 5 ans, utilisera un maximum de 150 souris. A notre connaissance, aucune méthode alternative et aussi fiable que la production d’anticorps polyclonaux chez l’animal n’est disponible. Comparés aux anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux (dirigés contre une seule fraction de la protéine d’intérêt) sont très spécifiques, mais également moins sensibles et ne peuvent donc pas répondre à notre objectif final qui est de capturer dans une matrice complexe des microsporidies présentent en faible quantité.

Les anticorps polyclonaux obtenus grâce à ce projet devraient nous permettre d’enrichir et purifier les spores de microsporidies présentes dans différentes matrices. En effet, la charge en microsporidies est souvent très faible. Dans l’exemple d’une station d’épuration, cela permettra de déterminer si les eaux d’entrée et de sortie de station sont positives, et si oui, d’identifier les génotypes présents grâce à des outils de séquençage et d’établir une surveillance de la circulation des microsporidies. Dans l’exemple des aliments, en cas d’épidémie suspectée dans la population, il sera possible de tester différents aliments, pour identifier celui responsable de l’épidémie. Ainsi de nombreuses applications pourront découler de la mise au point de cet outil d’immunocapture.

Manipulation des animaux lors de l’identification par micro-tatouage à la phalange à l’aide d’une seringue hypodermique. Manipulation des animaux lors de l’injection intra-péritonéale : contention et injection. Ces 2 interventions prennent en moyenne moins de 5 minutes par animal. Les animaux seront soumis à 5 injections sur la durée du projet. Manipulation des animaux lors de la mise en boîte à induction pour la réalisation de l’anesthésie gazeuse. Anesthésie gazeuse, puis prélèvement cardiaque sur animaux endormis, avant euthanasie de ces derniers. Ces interventions prennent en moyenne 10 minutes par animal.

Une inflammation liée à l’adjuvant de Freund peut survenir au site d’injection, et des lésions, de type ulcération et abcès, peuvent apparaître dans de très rares cas. Certains animaux peuvent avoir une modification de leur activité, et de leur aspect physique (pelage terne ou hirsute).

A l’issue de l’expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer la totalité du sang et donc les anticorps produits.

Deux raisons principales nous ont amenés à choisir la souris pour cette production d’anticorps. 1- les anticorps polyclonaux que nous envisageons de produire seront utilisés exclusivement à des fins de recherche pour des expériences (expériences d’immunolocalisation, d’immunocapture, mise au point d’ELISA) qui nécessitent de faibles volumes d’anticorps ; 2- les antigènes proviennent d’espèces éloignées phylogénétiquement de la souris, ce qui limite les risques de réactions croisées et la non validité des anticorps obtenus. De plus, aucune approche in vitro ne permet de produire des anticorps polyclonaux même s’il est possible en théorie, de créer des préparations « polyclonales » par mélange d’anticorps monoclonaux, eux-mêmes d’origine synthétique, mais ces mélanges (parfois appelés « multiclonaux ») ne reprennent jamais la totalité des performances des anticorps polyclonaux. Nous utiliserons des animaux nés à l’animalerie. A l’âge de 6-8 semaines, la première injection sera réalisée. Ainsi les 4 rappels seront réalisés entre 8-10 et 11-13 semaines. Cela nous permet de travailler sur des souris jeunes adultes qui ont une réponse immune suffisamment développée et qui ne sont pas encore (trop) affectées par des challenges immuns. De plus, la robustesse de la réponse immune diminue avec l’âge après le début de l’âge adulte.