Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2022-05-13 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-316592)
70 souris, dont dix femelles gestantes et leurs petits, vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur expose les mères à un polluant perfluoré, le PFOS, dans l’eau de boisson de la gestation au sevrage, puis euthanasie tous les souriceaux à 21 jours pour prélever leurs tissus. Il indique n’attendre aucune souffrance notable et s’appuie sur des données non publiées chez le rat. Il justifie le passage à la souris in vivo par les limites de ses précédents modèles ex vivo et sur têtard de xénope.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Depuis une trentaine d’années, l’incidence de la sclérose en plaques (SEP) est en constante augmentation dans les pays développés. Des facteurs environnementaux sont suspectés de favoriser le développement et/ou la progression de la SEP. Notre hypothèse centrale est qu’une exposition à des perturbateurs endocriniens, notamment les retardateurs de flammes que nous retrouvons dans notre environnement quotidien (revêtement des poeles, vêtements déperlants…) comme les fluorofactants, peut interférer avec le processus de formation de la myéline. En particulier, ces polluants chimiques étant liposolubles, notre hypothèse de travail est qu’ils s’accumulent dans les structures riches en lipides, comme la myéline, et destabilisent ainsi sa structure et sa fonctionnalité. Ce projet vise à comprendre dans quelle mesure certains perturbateurs endocriniens auxquels nous sommes tous exposés, les perfluorés (PFOS), affecte l’intégrité de la membrane myélinique. Il s’agit de la première étude visant à montrer un lien entre une exposition environnementale à un polluant chimique de type perturbateur endocrinien et la formation de la myéline. Ainsi, nous souhaitons explorer le rôle de l’acide perfluorooctanesulfonique ou PFOS dans la génération de nouveaux précurseurs oligodendrocytaires (OPCs) et la myélinisation chez le jeune souriceau. Pour ce faire, nous déterminerons les effets cellulaires au sein de la zone sous-ventriculaire, niche neurogénique majeure chez les mammifères pour la production d’OPCs. De plus, nous déterminerons si les PFOS s’accumulent dans les faisceaux de substance blanche et altère la composition en lipides de la membrane myélinique par des expériences innovantes d’imagerie par spectroscopie de masse. Les résultats de cette étude pilote devraient aboutir à un faisceau d’arguments visant à soutenir l’hypothèse d’un lien entre une exposition développementale à certains perturbateurs endocriniens et la génération de cellules myélinisante
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Cette approche in vivo menée chez la souris postnatale viendra compléter nos données récemment obtenues à l’aide de modèle ex vivo chez la souris (neurosphères, explants de cervelet) et in vivo chez le têtard de xénope. Plus largement, notre projet démontrera (ou non) si une exposition environnementale pendant le développement – à certains perturbateurs endocriniens, comme les perfluorés -modifie le profile lipidique de la membrane myélinique et la fragilise. Les bénéfices de cette étude pilote sont doubles : (i) une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires aboutissant à la production d’oligodendrocytes matures, processus susceptibles d’être affectés par les perfluorés chez tous les mammifères, y compris chez l’homme et (ii) l’apport d’une nouvelle voie d’étude témoignant du rôle néfaste des polluants environnementaux – auxquels nous sommes tous exposés tout au long de la vie – sur la stabilité de la myéline qui pourrait ainsi expliquer l’augmentation des cas de SEP via l’inhibition de la capacité à générer une myéline fonctionnelle.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les femelles recevront la molécule dans l’eau de boisson à partir du 15eme jour de gestation jusqu’au sevrage de la portée , les petits seront exposés in utero et lors de la lactation (de E15 à P21). A P21, tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Notre procédure unique soumise ici dans le cadre de ce projet pilote est considéré comme légère. Les animaux seront étroitement surveillés. Le poids des nouveau-nés sera suivi 2-3 fois par semaine. Si trop d’effets négatifs sont observés (prostration, non-alimentation, blessure), l’animal sera euthanasié et retiré du groupe expérimental. Cependant, cette expérience ne devrait pas induire de souffrance ou d’effets néfastes ni sur la femelle en gestation/lactation ni sur les petits jusqu’au stade de 21 jours après la naissance. Dans le cadre du projet européen ENDpoiNTs , auxquels nous participons , notre collaborateur a récolté un ensemble de données (pas encore publiées) chez le rat montrant que des doses orales de la molécule utilisée en dessous de 2mg/kg bw sont bien tolérées par l’animal, notamment sans conséquences délétères en période néonatale. De plus, un ensemble de publications confirme également l’absence de problèmes chez les rongeurs en période postnatale pour des doses autour de 2mg/kg bw, donné soit dans le régime alimentaire, soit dans l’eau de boisson, soit par gavage. Les dommages attendus sont donc réellement réduits. Les femelles gestantes seront regroupées par 2 ou 3 par cage. De plus, ne sachant pas si le PFOS modifie le goût de l’eau, la quantité d’eau absorbée par les mères gestantes et en lactation sera mesurée en pesant 2 à 3 fois par semaine les biberons. Ainsi, la prise hydrique des animaux exposés à la molécule pourra être comparée aux animaux contrôles. Cependant, aucun changement dans la consommation hydrique n’est attendue. En effet, une précédente étude menée chez la rate a montré que la consommation d’eau ne différait pas entre les animaux contrôles et traités.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car des prélèvements de tissus et analyses sont nécessaires post-mortem impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Dans une étude antérieure récente, nous avons accumulé des données à l’aide de modèles ex vivo (culture chez la souris) et in vivo (tétard de xénope) afin de répondre à un effort de remplacement et de réduction. Cependant, la nouvelle question qui découle de nos résultats prometteurs – obtenus par ces approches – nous incite à utiliser le modèle murin in vivo afin de reproduire au mieux les conditions d’une exposition environnementale aux perturbateurs endocriniens lors de la période périnatale et d’examiner les conséquences sur la physiologie de la myéline. Avec notre approche ex vivo précédemment décrite, nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés afin de répondre à notre question première, celle des effets des perfluorés sur la génération d’oligodendrocytes myélinisants et la remyélinisation. Désormais, nous devons valider in vivo chez la souris nos résultats car nos précédents modèles ex vivo ne nous permettent pas de répondre à la problématique de l’accumulation des perfluorés dans la substance blanche ni de ses conséquences sur la stabilité de la myéline. Par ailleurs, le modèle du tétard de xénope a permis de montrer un effet de cette molécule sur la remyélinisation au niveau du nerf optique. En revanche, nous souhaitons étudier en amont les mécanismes cellulaires à l’origine de la génération de nouveaux précurseurs oligodendrocytaires. Pour ce faire, nous nous focalisons sur la zone sous-ventriculaire chez la souris où sont concentrées les cellules souches neurales à l’origine des OPCs. Cette niche est parfaitement définie en terme de types cellulaires chez la souris, contrairement au xénope. De plus, la composition en lipides n’est pas connue chez le xénope alors qu’elle est parfaitement définie chez la souris. Or, nous voulons étudier l’influence d’une accumulation potentielle du perturbateur sur le profil lipidomique. Ceci nous pousse à explorer le lipidome chez la souris. Nous souhaitons ainsi étudier l’influence des perfluorés sur le choix du destin cellulaire des cellules souches neurales et a fortiori sur la génération des précuseurs oligodendrocytaires qui migrent ensuite dans le corps calleux où ils se différentient en oligodendrocytes myélinisants. Ce modèle in vivo nous permettra d’étudier l’impact des perfluorés sur toutes les étapes du lignage oligodendrocytaire, de la cellule souche à l’oligodendrocyte mature.
2. Réduction
Avec notre approche ex vivo précédemment décrite, nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés afin de répondre à notre question première, celle des effets des perfluorés sur la génération d’oligodendrocytes myélinisants et la remyélinisation. Désormais, nous devons valider in vivo chez la souris nos résultats car nos précédents modèles ex vivo ne nous permettent pas de répondre à la problématique de l’accumulation des perfluorés dans la substance blanche ni de ses conséquences sur la stabilité de la myéline. Nous avons volontairement restreint le nombre d’animaux utilisés dans ce projet afin de s’en tenir au strict minimum pour obtenir rapidement des résultats préliminaires qui devraient nous conforter dans notre hypothèse, à savoir que les PFOS, de part leur propriété hydrophobe et liposoluble, s’accumulent dans la gaine de myéline, structure riche en lipides. Ainsi, la membrane myélinique serait modifiée en sa composition lipidiques ce qui pourrait entraîner une déstabilisation de celle-ci, favorisant ainsi sa vulnérabilité. Au cours d’une précédente expérience, nous avons exposé des mères gestantes (de E15 à P21) à un autre perturbateur endocrinien, le bisphénol F. Les résultats ont mis en évidence qu’un nombre de 8 souriceaux par groupe était nécessaire et suffisant pour obtenir des données statistiques significatives et robustes. Dans l’actuelle procédure, nous estimons donc à 8 le nombre de souris par condition (contrôle versus PFOS). Trois expériences seront réalisées à l’issu de cette procédure, chacune composée de 8 animaux contrôlés et 8 animaux traités. Cependant, compte tenu que le nombre de petits par portée pour les souris C57bL/6 n’est pas prédictible à l’avance (en moyenne 5 à 6 petits), nous préférons envisager une marge de 20% pour le calcul du nombre de petits afinde pallier cette variabilité. Ainsi nous augmentons notre besoin à 10 souris P21 par groupe et donc 10 femelles gestantes, soit 70 animaux au total.
3. Raffinement
Les indicateurs comme la prostration, détectée par les animaliers ou par l’expérimentateur, l’absence d’alimentation (la diminution des quantités de nourriture disponible entre deux nourrissage est vérifiée par les animaliers), des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, grattement, léchage) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, agitation anormale ou hyperréactivité) sont particulièrement suivis. Dans le cas où un ou plusieurs des symptômes cités varie de manière significative, l’animal est dans un premier temps sorti de la procédure, et/ou euthanasié dans les cas les plus extrêmes. Une bonne maîtrise de la procédure et un suivi assidu des groupes expérimentaux doit prémunir de la survenue d’incidents de ce type. Comme déjà mentionné, nous ne nous attendons pas à un phénotype sévère. Cependant, il n’est pas à exclure que des cas isolés réagissent plus fortement au traitement. En particulier, pour les nouveaux-nés, une attention particulière sera portée au suivi hebdomadaire du poids. Tout signe d’atteinte du système nerveux central (inclinaison de la tête, spasmes, convulsions, troubles de l’équilibre) entraînera systématiquement le retrait de l’animal de la procédure et son euthanasie. Les femelles gestantes et en lactation seront placées par 2 ou 3 par cage. Elles ne seront donc pas isolées et garderont ainsi des contacts sociaux. De plus, les femelles pourront s’entraider durant la lactation et ce, jusqu’au sevrage des petits. Durant toute la durée du traitement (de E15 à P21), l’environnement des animaux sera enrichi à l’aide de papier kraft et d’une maisonnette en carton. Les femelles pourront également construire leur nid avec du coton.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle biologique choisi est la souris (Mus musculus). Ce choix est dicté par plusieurs raisons -théoriques : la souris étant l’espèce animale la plus étudiée en expérimentation animale, les connaissances accumulées par la communauté scientifique ont permis d’identifier de nombreux mécanismes physiologiques et comportementaux impliqués dans le maintien de la balance énergétique et le vieillissement. Par ailleurs, l’utilisation des outils de séquençage à haut débit a permis un assemblage complet du génome de la souris, constituant un outil essentiel dans la détermination des gènes impliqués dans les processus étudiés. Pratiques : étant de petite taille, la souris est un modèle facile à maintenir en animalerie, avec un taux de reproduction élevé. Par ailleurs, tous les protocoles utilisés dans les projets de recherche ont été optimisés pour la souris, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. La souche C57bL/6 est notre souche de référence. La procédure sera réalisée sur des souris à P21 afin d’étudier les effets à court terme d’une exposition périnatale à un perturbateur endrocrinien sur la physiologie de la myéline. 60 nouveau-nés sont prévus afin de réaliser trois analyses pilotes post-mortem faisant appel à des expériences d’immunohistochimie, d’imagerie par spectrométrie de masse et d’analyses lipidomiques par spectrométrie de masse après extraction de la myéline. De plus, la procédure fait appel à de jeunes femelles gestantes afin de générer les nouveau-nés impliqués dans la procédure. Au sein d’un même cage, deux à trois femelles gestantes seront exposées soit à l’eau de boisson standard soit à l’eau supplémentée avec le perturbateur. A P21, les animaux d’une même condition (contrôle versus traité) seront sexés puis divisés en 3 groupes (chaque groupe correspondant à une expérience). Pour chaque condition expérimentale, nous attendons 30 souriceaux. Ainsi, les 30 souriceaux issus des 5 femelles contrôle ou traitées seront mélangés et répartis en 3 groupes selon leur poids et leur développement, le but étant d’avoir trois groupes expérimentaux homogènes. Dans cette procédure, nous débuterons l’exposition des embryons à E15, juste avant que le système endocrinien du souriceau ne devienne autonome. Les souriceaux seront exposés jusqu’à P21, stade post-développemental où la myélinisation est maximale.