Histoire naturelle et études pilote de thérapie génique chez la souris PKP2_Het, modèle animal de la cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène (CVDA)

La Plakophiline 2 (PKP2) est une protéine codée par le gène PKP2. On la trouve en abondance dans la peau et le muscle cardiaque, où elle fait le lien entre différentes protéines. Dans le cœur, elle se trouve au niveau des jonctions cellulaires, où elle participe activement à la connexion mécanique intercellulaire et à la propagation du signal necéssaire aux contractions cardiaques. Une mutation du gène PKP2 provoque une cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène (CVDA). Cette maladie est caractérisée par le remplacement progressif du muscle cardiaque dans le ventricule droit par du tissu graisseux et fibreux. Le cœur perd alors sa contractilité et il en résulte à terme une mort subite, pouvant être déclenchée par l’exercice. Il n’existe actuellement pas de traitement. PKP2 est une protéine assez conservée entre les espèces. Par conséquent, l’étude de la déficience en PKP2 dans des modèles animaux est une approche pertinente. La majorité des mutations du gène PKP2 chez l’homme entraînent une haplo-insuffisance, ce qui signifie que la présence d’environ 50 % seulement de la protéine normale dans le cardiomyocyte entraîne la maladie. Si des modèles de souris haplo-insuffisantes pour PKP2 ont été générées par le passé (avec quelques résultats publiés dans la littérature), aucun modèle de souris transgénique de ce type n’est disponible aujourd’hui sur le marché ou via des collaborations. Afin de comprendre le phénotype de la maladie chez la souris et de surtout pouvoir tester des approches thérapeutiques, un nouveau modèle de souris transgénique mutée sur le gène PKP2 murin a été généré. Nous souhaitons aujourd’hui (i) caractériser la pathologie de ce nouveau modèle de souris appelé PKP2_Het, et (ii) en cas de pathologie avérée, évaluer une approche thérapeutique de thérapie génique. C’est l’objet de ce projet, qui est donc divisé en 2 parties.

La CVDA est une cardiomyopathie héréditaire caractérisée par un remplacement progressif des cardiomyocytes par du tissu graisseux et fibreux. Les syndromes observés sont des troubles du rythme cardiaque, qui causent une mort subite chez les adultes jeunes et les sportifs (l’effort étant un facteur déclenchant de la mort subite). La prévalence de la CVDA est estimée entre 1/2000 et 1/5000. Une mutation du gène PKP2 est impliqué dans 70 à 90% des cas de CVDA. Le traitement actuel repose sur la prise de bêtabloquants parfois en association avec des anti-arythmiques, l’ablation par radiofréquence, l’implantation d’un défibrillateur automatique implantable (« pace-maker »), et plus généralement le traitement de l’insuffisance cardiaque. La pratique sportive est clairement contre-indiquée, même chez les jeunes patients. L’évaluation d’approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d’un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, avoir un modèle animal pertinent est nécessaire pour pouvoir réaliser des études précliniques nécessaires (preuves de concept de l’efficacité des produits thérapeutiques, études de dose…). Le présent projet vise à évaluer la pertinence d’un nouveau modèle murin créé pour mimer cette pathologie, et en cas de pertinence avérée, réaliser une étude pilote pour évaluer l’efficacité d’un traitement de thérapie génique. C’est une étape essentielle dans le développement préclinique qui permettra à terme de proposer un traitement curatif aux patients atteints de CVDA.

Pour l’étude d’histoire naturelle du modèle de souris étudié, les animaux seront soumis aux interventions suivantes: – Biopsie de queue pour génotypage (1 biopsie / animal): 2 min – Evaluation de la fonction cardiaque sur animaux anesthésiés, avec induction de stress adrénergique (1 test par animal): 20 min, puis sans réveil de l’animal : prélèvement sanguin (2 min), avant mise à mort. Pour l’étude pilote pour l’évaluation de l’efficacité d’une approche thérapeutique de thérapie génique, les animaux seront soumis aux interventions suivantes: – Biopsie de queue pour génotypage (1 biopsie / animal): 2 min – A un âge déterminé lors de l’étude d’histoire naturelle : injection unique d’un vecteur de thérapie génique ou de véhicule, sous anesthésie ou bien sur animal vigile, selon le site d’injection choisi (1 injection / animal):10 min max – Prélèvements sanguins au niveau d’une veine sous-mandibulaire (2 prélèvements / animal, avant injection, puis avant la mise à mort): 5 min – Evaluation de la fonction cardiaque sur animaux anesthésiés, avec induction de stress adrénergique (1 test par animal): 20 min, puis sans réveil de l’animal : prélèvement sanguin: 5 min, avant mise à mort.

(i) Injection intraveineuse: l’injection intraveineuse réalisée dans la veine caudale se fera sous contention et pourra provoquer un stress léger le temps de l’injection (moins de 10min), et une petite douleur au niveau du site de ponction. L’injection intraveineuse par voie rétro-orbitale se fera sous anesthésie et ne provoquera pas de stress ou de douleur à l’animal. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur viral chez la souris est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d’un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) ECG et échocardiographie trans-thoracique : geste non invasif, réalisé sur animal anesthésié pour éviter tout stress à l’animal. (iii) Injection intrapéritonéale d’un mélange d’isoprénaline et de phényléphrine : injection réalisée sous anesthésie générale, donc sans douleur pour l’animal. Par contre, le stress adrénergique qui sera alors appliqué pourrait induire, chez les animaux malades, une arythmie accrue et une mort subite. Cela pourrait toucher environ 20% des animaux (données obtenues dans d’autres modèles d’arythmies cardiaques). Sachant que ce stress sera induit juste avant la mise à mort des animaux (sans interruption de l’anesthésie entre l’évaluation de la fonction cardiaque et la mise à mort), cela n’aura pas d’impact négatif sur les animaux. (iv) Prélèvement sanguin terminal chez la souris au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour l’animal, puisque cet examen sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

A l’issue de cette étude, tous les animaux de cette étude seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses histologiques et moléculaires nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l’animal.

PKP2 est une protéine assez conservée entre les espèces. Par conséquent, l’étude de la déficience en PKP2 dans des modèles animaux est une approche pertinente. Le modèle de souris étudié dans ce projet est partiellement déficiente pour PKP2, comme les patients atteints de cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène (CVDA). Dans ce sens, elle se révèle être un modèle animal pertinent pour notre étude. Pour l’étude d’histoire naturelle, la caractérisation sera réalisée à différents âges, afin d’évaluer le processus évolutif de la maladie, et définir à quel âge il serait pertinent de traiter les animaux lors des études thérapeutiques. Chez l’homme, la pathologie se met en place progressivement et les 1ers symptômes de la CVDA débutent le plus souvent entre 20 et 40 ans (soit au stade adulte). Nous avons donc choisi d’analyser les animaux à l’âge de 3, 6, 9 et 12 mois (également au stade adulte donc). Pour l’étude pilote d’évaluation de l’efficacité d’une approche thérapeutique de thérapie génique, l’âge d’injection sera défini selon les résultats obtenus dans l’étude d’histoire naturelle, cet âge étant choisi pour être un âge où des 1ers symptômes de CVDA peuvent être observés chez les souris après application d’un stress adrénergique.