Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 24/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-350500)
304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les mâles porteurs de la myopathie myotubulaire développent une faiblesse musculaire généralisée qui gêne leurs déplacements et leur accès à la nourriture, puis reçoivent une injection de vecteurs, des mesures de force et des prélèvements de muscle sous anesthésie sans réveil. Le porteur teste dix vecteurs de thérapie génique pour réduire les doses et les effets sur le foie observés en clinique. Il juge l’animal « indispensable » car les modèles cellulaires ne reproduisent pas la perte de force musculaire, les retombées thérapeutiques restant à venir.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Il n’existe aucun traitement approuvé pour la myopathie myotubulaire, une maladie congénitale sévère affectant les garçons et entrainant la mort prématurée souvent avant un an. Cette maladie est due à des mutations dans le gène MTM1 qui code pour la myotubularine. Sa déficience implique une hypotrophie et une faiblesse musculaire généralisées entraînant une difficulté respiratoire. Dans un essai clinique en cours, un vecteur de type AAV (dérivé de virus associé à l’adénovirus) est injecté par voie intraveineuse pour introduire le gène MTM1 dans les muscles des patients. Ce produit a déjà été testé dans des souris déficientes en myotubularine et dans un modèle canin. Dans ces modèles animaux, ce traitement a permis d’obtenir une restauration du phénotype. Cependant, le vecteur AAV8 utilisé ne cible pas spécifiquement les cellules du muscle et la quantité de vecteurs nécessaire pour un effet thérapeutique est élevée ce qui peut engendrer des effets indésirables notamment sur le foie. Le but de ce projet est de sélectionner dans le modèle murin de la myopathie myotubulaire des vecteurs plus efficaces et spécifiques pour le muscle, qui pourraient également être utilisés pour traiter d’autres pathologies musculaires, ce qui permettrait de réduire les doses de vecteur à administrer chez les patients. Le(s) vecteur(s) optimisés pourront être associés à des stratégies de correction permanente de la pathologie pour un effet thérapeutique synergique et durable.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Cette étude permettrait de proposer une solution thérapeutique plus efficace et plus spécifique que le traitement de référence, dans le contexte de la myopathie myotubulaire. Grâce à l’étude de différents critères, nous espérons sélectionner un ou des candidats permettant de traiter ce modèle animal à une dose plus faible que le vecteur de référence. Cette diminution de quantité de vecteurs engendrera certes une diminution du coût mais surtout réduira les effets indésirables liés à des doses élevées. En effet, dans des essais cliniques de maladies neuromusculaires traités par vecteur AAV, notamment dans le contexte de la myopathie myotubulaire, des effets dommageables sur le foie, par exemple, ont été reportés et sont en partie corrélés à la dose importante de vecteurs injectés. Les vecteurs sélectionnés pourraient également être associés à d’autres stratégies d’optimisation de l’expression de la protéine, étudiées dans d’autres études, pour augmenter l’efficacité du traitement. Enfin, les bénéfices attendus pourraient s’étendre à d’autres pathologies neuromusculaires telles que la myopathie de Duchenne ou tout autre myopathie ou dystrophie touchant essentiellement les muscles, puisque cet outil de transport de gène médicament étudié ici peut être simplement modifié en changeant le gène transporté sans affecter l’efficacité et la spécificité de cet AAV à cibler le muscle.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Injection des traitements dans la veine caudale : injection unique, environ 2 min par souris. Mesure de l’activité des animaux : 1 fois 1h30. Mesure de la force musculaire globale : 1 fois 10min par souris. Mesure de la force spécifique d’un muscle, sur animaux vivants anesthésiés : environ 1h15 par souris. Prélèvements de muscles sur animaux vivants anesthésiés sans réveil: prélèvements uniques, environ 5 min par souris. Prélèvements sanguins sur animaux vivants anesthésiés : 1 prélèvement, maximum 5 min par souris.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il n’exprime pas la protéine myotubularine. Les mâles hémizygotes développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leur déplacement et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Il n’y a pas d’effets indésirables prévus suite aux traitements, sauf dans le cas d’une injection à dose sub-optimale, auquel cas, les nuisances seront liées à celles du modèle. Le test de force musculaire globale peut générer une légère nuisance liée au pincement de la queue, générant rarement un léger saignement. Les injections intraveineuses et intra-péritonéales (traitements ou anesthésiques) ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère liée à la piqûre. Il n’y a pas d’effet indésirable lié à la mesure de la force spécifique d’un muscle et au prélèvement de muscle ou de sang sur animal vivant puisque celui-ci est anesthésié puis euthanasié à la fin de la procédure.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Certaines des souris issues des croisements mais ne présentant pas de pathologie seront utilisées pour les croisements nécessaires au maintien et à l’amplification de l’élevage. Les animaux issus des croisements mais ne présentant pas de pathologie et non nécessaires au maintien et à l’amplification de l’élevage seront euthanasiés. Toutes les souris présentant le phénotype pathologique seront incluses dans les procédures expérimentales, et seront euthanasiées à la fin de la procédure expérimentale ou en cours de procédure si leur état de santé le nécessite.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation d’animaux est indispensable pour faire des preuves de concepts thérapeutiques, car les modèles cellulaires de la maladie ne permettent pas d’étudier les défauts liés à la fonction du muscle (perte de force non mesurable sur des modèles cellulaires, pas de remplacement possible), et ne permettent pas non plus d’étudier la répartition d’un vecteur dans l’ensemble des tissus et les niveaux de biomarqueurs de la pathologie dans le sang. A l’opposé, le modèle de souris qui sera utilisé dans ce projet reproduit la pathologie musculaire avec fidélité, ce qui permet de mesurer dans le temps et de façon prédictive de la clinique (c’est-à-dire chez l’homme) l’efficacité des traitements sur l’ensemble des muscles squelettiques et la distribution du vecteur dans les différents organes pour analyser leur spécificité.
2. Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de tests statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux pour observer des différences entre les vecteurs testés. En amont de cette étude expérimentale sur des modèles animaux, nous avons créé à l’aide d’outils informatiques et de recherches bibliographiques des vecteurs AAV avec un fort potentiel pour cibler les cellules musculaires. Par des tests in vitro, nous avons sélectionné ensuite les 10 meilleurs candidats. La première étape de ce projet nous permettra d’évaluer l’efficacité de ces 10 vecteurs pour cibler l’ensemble des muscles et traiter la myopathie myotubulaire. Les meilleurs candidats seront sélectionnés afin de déterminer la dose thérapeutique optimale. En ne testant pas directement tous les vecteurs à différentes doses, nous réduisons par 3 le nombre de souris pour les vecteurs qui ne retiendront pas notre intérêt. S’il s’avère qu’aucun des vecteurs n’améliore le phénotype de la maladie par rapport au vecteur référence dans la première étape de sélection de vecteurs, la procédure expérimentale pour déterminer la dose optimale ne sera pas réalisée.
3. Raffinement
Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies. Un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès aux souris. Dès leur arrivée en zone d’expérimentation, les souris seront manipulées afin d’être familiarisées aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux, dans le but de réduire leur stress. Les prélèvements sanguins ou les évaluations de force musculaire seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress de l’animal lié à l’acte et assurer son immobilité. Des points limites adaptés ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement afin de minimiser les effets indésirables, avec une mise à mort anticipée si nécessaire.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Repris automatiquement des 3.4.3 et 3.4.11 Les souris déficientes en myotubularine ont été choisies comme animaux modèles pour deux raisons : 1) Ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène Mtm1, responsable de la myopathie myotubulaire, ce qui en fait le plus petit modèle animal le mieux caractérisé reproduisant les signes cliniques et moléculaires, caractéristiques de la maladie humaine. 2) La gestation étant de 3 semaines, les animaux nécessaires peuvent être obtenus rapidement. Les souris mâles saines et les femelles hétérozygotes pour la mutation sur le gène Mtm1 seront mises en reproduction entre l’âge de 6 semaines et de 1 an, ou seront euthanasiés si les accouplements ne sont plus productifs ou si les points limites sont atteints. Les symptômes de la maladie apparaissent dès la troisième semaine de vie chez les souris mâles hémizygotes. Notre étude vise à corriger les symptômes de la myopathie myotubulaire : les animaux mâles porteurs de la mutation seront donc utilisés juste après l’apparition des premiers symptômes (essentiellement un gain de poids plus faible que les animaux sains).