Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/02/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-358066)
Pour reproduire des mutations humaines du gène GRID1 liées à une déficience intellectuelle, 324 souris sont utilisées dans des procédures d’un niveau de souffrance modéré pour 300 d’entre elles, les 24 autres étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Selon les groupes, elles subissent une injection intracérébrale de vecteurs viraux de trente à quarante-cinq minutes, un prélèvement de liquide céphalorachidien, un prélèvement sanguin et une amputation de deux millimètres de queue pour génotypage, toutes étant tuées pour analyse du cerveau. Le porteur décrit une perte de poids et une douleur de vingt-quatre à quarante-huit heures après chirurgie, ainsi qu’un risque de détresse respiratoire ou d’arrêt cardiaque sous anesthésie, et qualifie ces chirurgies d' »indispensables » à son projet. Une partie des souris est tuée sous anesthésie pour éviter, écrit-il, la souffrance qu’entraînerait leur réveil après la ponction de liquide céphalorachidien.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les protéines impliquées dans la communication entre les neurones jouent un rôle important dans le fonctionnement du cerveau, et des mutations humaines de ces protéines sont associées à la schizophrénie et à l’autisme. Il a récemment été identifié des mutations de ces protéines liés à une déficience intellectuelle avec paraplégie spastique, avec ou sans glaucome. L’expression de ces mutants dans des cultures neuronales de souris entraîne une altération de la physiologie du neurone et des connexions entre neurones. Il a également été généré une lignée de souris mutantes comportant une de ces mutations. Ce projet vise à : i) caractériser les altérations de ces souris mutantes aux niveaux neurophysiologiques, neurochimiques, anatomiques et génomiques afin de les comparer aux altérations observées par nos collaborateurs chez les patients humains, ii) caractériser l’impact de l’expression à l’âge adulte des récepteurs mutants susmentionnées sur les propriétés anatomiques et électrophysiologiques des neurones de souris sauvages pour en distinguer les effets aigus des effets neurodeveloppementaux. Ce projet permettra de caractériser les signatures pathologiques et les processus physiopathologiques liés aux mutations humaines de ces récepteurs.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
A terme, ce projet aboutira à une meilleure compréhension des pathologies liées aux variants des récepteurs du glutamate chez l’humain (schizophrénie, autisme, déficience intellectuelle, paraplégie spastique) et à identifier des cibles pour de futures thérapies visant à les soigner.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux subiront une des trois interventions suivantes : 1) Prélèvement sanguin sur animaux adultes de 2 mois sous anesthésie générale gazeuse et sous anesthésie locale. Cette procédure dure 5-10 min et est immédiatement suivie d’une euthanasie des animaux anesthésiés. 2) Prélèvement de liquide céphalorachidien sur animaux adultes de 2 mois sous analgésie générale et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30 min et est immédiatement suivie d’une euthanasie des animaux anesthésiés. 3) Injections intracérébrales de vecteurs viraux sur animaux de 4-6 semaines sous analgésie générale et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 4-6 semaines après l’injection, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire (15 min).4) Prélèvement caudal (2mm de long) à des fins de genotypage durée : 15min
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les procédures de chirurgie peuvent être à l’origine d’une perte de poids transitoire (inférieure à 20 pour cent de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48h. Néanmoins elles sont indispensables à notre projet car seules ces chirurgies permettent d’exprimer les récepteurs d’intérêt à l’âge adulte dans des régions cérébrales spécifiques afin d’en distinguer les effets aigus et locaux des effets neurodeveloppementaux ou indirects. Durant les phases d’anesthésie, les animaux pourraient subir un stress thermique, une détresse respiratoire ou un arrêt cardiaque. Pour les besoins de genotypage, les souris subiront un prélèvement caudal qui pourrait causer un stress ou une douleur de courte durée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront euthanasiés, soit afin de prélever le cerveau pour analyse des caractéristiques génomiques, anatomiques et fonctionnelles du tissu cérébral, soit afin de valider le protocole de prélèvement post-mortem du liquide céphalorachidien, soit encore afin d’éviter la souffrance au réveil après prélèvement du liquide céphalorachidien sous anesthésie générale.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le cerveau est un organe très complexe qui comprend des milliards de neurones de centaines de types différents, dont chacun établit des milliers de connexions avec d’autres neurones, et qui sont rassemblés en structures largement connectées entre elles et/ou avec d’autres organes. En raison de cette complexité, il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative non-animale à l’étude de l’impact sur les structures et les fonctions cérébrales d’une mutation bi-allélique responsable de déficience intellectuelle et de paraplégie spastique chez l’humain.
2. Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été calculé considérant l’expérience des utilisateurs de l’équipe en chirurgie, électrophysiologie, histologie, des résultats précédemment obtenus au laboratoire et des données de la littérature, et sur la base d’un seuil de significativité et d’un calcul de puissance. Compte tenu de l’expérience des utilisateurs de l’équipe et des taux de succès indiqués dans la littérature, le nombre d’animaux utilisés a été réduit aux besoins minimaux d’apprentissage et de test et à la détection d’une différence significative entre les souris sauvages et mutantes. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Nbre total d’animaux:324
3. Raffinement
Les animaux sont hébergés en accord avec la directive 2010/63/EU . Ils sont dans un environnement enrichi par la présence de matériau végétal pour édifier un nid. Ils sont visités chaque jour. Ils seront acclimatés 5 à 7 jours dans la zone d’hébergement et manipulés chaque jour pour réduire le stress le jour de la procédure. Pour les procédures avec chirurgie, l’animal reçoit une injection d’un analgésique général pour prévenir la douleur, puis est placé sous anesthésie générale gazeuse et disposé sur un tapis chauffant, puis reçoit une injection d’un anesthésique local avant la première incision. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Pour les procédures avec réveil, l’animal reçoit après chirurgie une injection de solution saline afin de prévenir la déshydratation et est placé dans une cage posée sur un tapis chauffant jusqu’au réveil. Après récupération, il réintègre sa cage d’origine, son comportement est surveillé et la suture est sous observation quotidienne pour évaluer sa bonne cicatrisation. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les conseils vétérinaires. Après chirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de détecter tout signe de douleur ou stress et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques selon les conseils du vétérinaire référent. Les points limites seront : a) une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire, b) modification du comportement caractéristique d’une douleur, détresse ou souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté), c) perte de poids supérieure ou égale à 20 pour cent. Une pesée sera effectuée avant l’anesthésie puis quotidiennement pendant 3 jours après. Les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie par injection d’une dose létale d’euthanasiant. L’euthanasie des animaux par décapitation, exsanguination ou injection d’une dose létale d’euthanasiant sera effectuée par une personne experte.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système nerveux central avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant une mutation du récepteur du glutamate liée à un syndrome associant pathologie nerveuse centrale et périphérique. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Des animaux adultes seront utilisés afin d’évaluer l’impact sur l’animal de la mutation du récepteur du glutamate et de comparer les altérations biochimiques et génomiques avec celles observées par nos collaborateurs sur des patients adultes porteurs de cette mutation et sur des neurones corticaux matures issus de cellules souches pluripotentes humaines portant la même mutation. Des animaux de 4 semaines seront utilisés afin de permettre l’expression des transgènes par les vecteurs viraux (4 à 6 semaines) avant de réaliser les expériences sur les animaux d’âge adulte.