Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 05/08/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-370759)
Issus d’un programme de croisements mené sur quatre générations, 2 250 médakas vont être utilisés pour établir des lignées mutantes, puis tués une fois ces lignées devenues inutiles. 950 d’entre eux relèvent d’un niveau de souffrance léger, 1 300 d’un niveau modéré. Chacun subit sous anesthésie le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale de moins de deux millimètres carrés, geste que le porteur qualifie de bref et peu invasif tout en indiquant qu’il génère une douleur durant plusieurs heures, puis un isolement en aquarium individuel pouvant atteindre vingt-quatre heures. Les deux analyses de comportement prévues à quatorze semaines sur la troisième génération ne sont pas décrites, renvoyées à une demande d’autorisation ultérieure, et le porteur affirme qu’aucun autre modèle expérimental ne permet aujourd’hui de répondre à ce type de question.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’histoire de vie des individus et les stress auxquels ils ont été soumis peuvent façonner le développement du cerveau et le comportement de leur descendance via des modifications non-génétiques de leur gamète, c’est-à-dire des modifications n’impactant pas la séquence d’ADN héritée par la descendance. Les mécanismes sous-jacents restent cependant encore peu connus chez les vertébrés, particulièrement côté maternel. En effet, de nombreuses études décrivant des effets intergénérationnels associent l’exposition à un stress parental à des modifications non-génétiques des gamètes et/ou à des modifications phénotypiques de la descendance, particulièrement côté paternel. Les études portant sur des effets maternels sont plus rares et concernent le plus souvent des stress post-conception (notamment durant la gestation chez les mammifères), ne rentrant pas dans la définition stricte d’effets intergénérationnels. Bien qu’informatives, ces études décrivent des effets corrélatifs mais sans démonstration de relation causative évidente entre modifications non-génétiques des gamètes et modifications phénotypiques chez la descendance. A l’inverse, ce projet vise à identifier de nouveaux gènes impliqués dans le contrôle maternel non-génétique du neurodéveloppement et du comportement en tirant profit d’un modèle de poisson vertébré ayant déjà fait ses preuves dans une précédente étude du même type.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
De nombreuses études décrivant des effets intergénérationnels associent l’exposition à un stress parental à des modifications non-génétiques des gamètes et/ou à des modifications phénotypiques de la descendance. Bien qu’informatives, ces études décrivent des effets corrélatifs mais sans démonstration de relation causative évidente entre modifications non-génétiques des gamètes et modifications phénotypiques chez la descendance. A l’inverse, l’approche utilisée dans ce projet permettra d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans le contrôle maternel non-génétique du neurodéveloppement et du comportement. A plus long-terme, ces données pourraient être utilisés pour comprendre l’adaptation de certaines espèces animales, dont des espèces commerciales, aux stress environnementaux dans un contexte de changement climatique. Elles apporteront également des éléments de connaissance nouveaux dans le déterminisme non-génétique des troubles du neurodéveloppement.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Il s’agit de la création de lignées mutantes, avec procédure de fin clip pour leur génotypage. Les animaux subiront, sous anesthésie, un prélèvement d’un petit fragment de nageoire caudale (moins de 2 mm²) afin de permettre leur génotypage et l’établissement des lignées mutantes. L’anesthésie est réalisée par balnéation dans une solution anesthésiante, assurant l’absence de réflexes et de douleur pendant la procédure. Cette manipulation dure moins de 3 minute temps d’induction en anesthésie compris avec un réveil très rapide. Les deux analyses de comportement qui seront réalisées à 14 semaines sur les animaux de 3ème génération ne sont pas décrits car elles feront l’objet d’une nouvelle DAP dans laquelle elles seront décrites précisément.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les gènes ciblés dans ce projet jouent un rôle crucial dans le développement du cerveau et ont été impliqués dans des troubles du neurodéveloppement tels que le retard mental et les troubles du spectre autistique. Leur invalidation est susceptible d’entraîner des altérations comportementales, notamment une inhibition des comportements traduisant l’anxiété et une diminution des capacités d’apprentissage. Cependant, l’inactivation génique peut également provoquer des effets hors cible, c’est-à-dire des mutations involontaires en dehors des gènes ciblés. Ces effets sont difficilement prédictibles et peuvent avoir des conséquences variables sur d’autres fonctions physiologiques, allant d’effets bénins à des perturbations plus significatives. Bien que des stratégies de validation et de sélection des lignées soient mises en place pour limiter ces risques, il n’est pas possible de les exclure totalement. Par ailleurs, la procédure de génotypage nécessite une biopsie de la nageoire caudale pratiquée sous anesthésie. Cette intervention, très rapide (moins de 3 minutes/poisson), peut entraîner une douleur légère et transitoire, bien que des mesures de raffinement soient mises en œuvre pour en limiter l’impact. Après la biopsie, les animaux sont isolés temporairement (
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux sont euthanasiés après 4 générations (F0 à F3) car les lignées ne seront pas maintenues au-delà des tests de l’analyses préliminaires (et de comportement à 14 semaines le cas échéant).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’objet du projet étant d’évaluer le rôle de certains gènes dans le contrôle maternel non-génétique du comportement, il nécessite par son essence l’utilisation de modèles expérimentaux animaux. Aucun autre modèle expérimental ne permet à l’heure actuelle de répondre à ce type de question scientifique.
2. Réduction
Dans ce projet, nous prévoyons de produire 450 poissons pour chaque lignée étudiée. Ces poissons proviennent d’un programme d’élevage en plusieurs étapes. D’abord, des poissons génétiquement modifiés sont croisés avec des poissons de génotype « sauvage » (c’est-à-dire sans modification génétique). Cela donne une première génération composée pour moitié d’individus porteurs d’une seule copie de la mutation étudiée. Ensuite, pour obtenir la deuxième génération, nous croisons ces individus hétérozygotes de la première génération avec d’autres poissons de génotype « sauvage ». Ce croisement permet d’obtenir, une moitié des animaux hétérozygotes, un quart d’animaux qui possèdent deux copies de la mutation (appelés homozygotes mutant) et un quart qui n’en portent aucune (animaux dits homozygotes de génotype « sauvage »). C’est parmi ces homozygotes mutants et ces homozygotes de génotype « sauvage » que seront sélectionnés les poissons géniteurs de la troisième génération qui sera utilisée pour les expériences. Tout au long du processus, le nombre d’animaux produits sera limité au strict nécessaire pour garantir des résultats fiables dans les différentes analyses comportementales prévues. Cela permet de respecter au mieux le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la qualité scientifique du projet.
3. Raffinement
Les mêmes animaux seront utilisés pour effectués les deux tests de prévus dans le projet. Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums contenant 9,5 litres avec la densité de 25 animaux maximum/aquarium. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte, le prélèvement d’œufs ou la mise en balnéation seront réalisées par du personnel compétent le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement par les zootechniciens. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à l’invalidation génique des gènes cibles) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier) et la Structure Bien etre de l’établissement sera immédiatement avertie. Pendant la procédure de biopsie pour le génotypage, les animaux sont anesthésiés par balnéation dans une solution d’anesthésiant. L’efficacité de l’anesthésie est confirmée par le ralentissement net des mouvements respiratoires et l’absence de réponse à un pincement de la nageoire caudale. Une biopsie d’environ 2 mm2 est prélevée à l’extrémité de la nageoire caudale à l’aide de ciseaux fins désinfectés. Cette procédure, brève et peu invasive, génère une douleur durant plusieurs heures. Afin de limiter la douleur, l’anesthésie est maintenue pendant toute la durée de la manipulation, et les animaux sont replacés en eau propre pour un réveil progressif. Après la biopsie, les animaux sont isolés individuellement pour une durée maximale de 24 heures, en attendant les résultats du génotypage. Bien qu’en aquarium individuel, le contact visuel avec leurs congénères est préservé afin de limiter le stress lié à l’isolement. Bien que cette méthode soit sans risque notable et maîtrisée, tout poisson montrant des signes de mal-être ou de comportement anormal dans les 24h suivant la biopsie est immédiatement retiré de l’expérimentation et euthanasié selon les procédures définies.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les petits poissons téléostéens comme le médaka sont de plus en plus utilisés en laboratoire pour étudier la reproduction, le développement et certains troubles du développement du cerveau. Ils présentent plusieurs avantages : leur génome est connu, les mutations de gènes sont réalisables, et ils sont faciles à élever en milieu contrôlé. Ils ont un cycle de vie court (environ 3 mois), pondent beaucoup d’œufs chaque semaine, ce qui permet d’obtenir de nombreux descendants. Contrairement aux mammifères, leurs œufs se développent à l’extérieur du corps de la mère, ce qui simplifie l’étude des effets transmis d’une génération à l’autre. En effet, chez les mammifères, il est difficile de savoir si certains effets sur les descendants viennent de la gestation, de l’allaitement ou du comportement maternel. Avec les poissons comme le médaka, il est possible d’isoler les vrais effets intergénérationnels. Dans ce projet, les poissons de la deuxième génération seront utilisés comme parents à partir de 3 mois (leur maturité sexuelle). Les tests de comportement seront faits sur la troisième génération à 14 semaines, comme dans l’étude précédente. Les animaux F2 seront utilisés à l’âge adulte, soit à partir de 3 mois, au moment de leur maturité sexuelle comme géniteurs de la génération F3. Les analyses comportementales auront lieu sur la génération F3 âgée de 14 semaines comme pour notre précédente étude.