Imagerie et modélisation des circuits sensorimoteurs à l’échelle du cerveau entier de la larve de poisson zèbre

Comprendre comment le cerveau intègre les multiples informations sensorielles dans son environement afin de produire un comportement approprié est un objectif fondamental des neurosciences. La dynamique cérébrale qui sous-tend ces mécanismes d’intégration est largement distribuée à travers l’ensemble du système nerveux. Son étude requiert donc de pouvoir enregistrer à l’échelle cellulaire l’activité d’une large fraction des neurones. A l’heure actuelle, il n’existe pas de système de réseau de neurones in-vitro comparable à un cerveau entier. La compréhension de sa structure à grande échelle nécessite donc le recours à l’expérimentation animale. Nous utiliserons un organisme modèle vertébré, la larve de poisson zèbre, (Danio Rerio). Cet animal présente à l’état larvaire un ensemble d’atouts – comportements stéréotypés, cerveau de petite taille, transparence des tissus, accessibilité génétique. Cela nous permet d’utiliser des lignées exprimant des rapporteurs optiques de l’activité neuronale pour enregistrer, in vivo et de maniere non invasive, l’activite neuronale de l’ensemble du cerveau, par microscopie optique avec une résolution subcellulaire. Obtenir des données dans plusieurs régions du cerveau simultanément permet ainsi de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés ainsi que le nombre et la durée des manipulations de chaque animal. Au total, 4395 larves de poisson zèbre (Danio Rerio) seront nécessaires pour ce projet de 5 ans. Le stade larvaire du poisson zèbre va d’environ 3 jpf (jours après fécondation) à 21 jpf. Nou utilisons des larves âgées de 6 à 14 jours, un âge où elles sont encore relativement transparentes. Ces larves sont issues de croisements de poissons adultes dans notre animalerie. Nous manipulerons ces larves avec un soin extrême, car nos projets exigent le minimum de perturbations possible pour recueillir des données comportementales et neuronales naturelles et fiables. Notre objectif est d’utiliser ces nouvelles approches expérimentales, couplées à des méthodes de physique statistique et d’apprentissage machine. Notre but est de produire un modèle numérique de la dynamique du cerveau vertébré qui rende compte à la fois de son activité endogène et des processus d’intégration multi-sensorielle et motrice lorsque l’animal évolue dans son environnement.

L’objectif est de développer un modèle d’interaction d’un vertébré avec son environnement complexe. Les bénéfices attendus sont des avances dans la connaissance scientifique sur l’intégration des stimulus multi-sensoriel et leur hiérarchisation dans la prise de décision motrice. La larve de poisson zèbre dispose par ailleurs d’un riche répertoire de comportements qui ouvrent la possibilité d’étudier les processus d’intégration sensorimotrices dans des contextes éthologiquement pertinents. Ainsi, ce projet devrait également permettre de valider l’utilisation de ce petit modèle dans le cadre du remplacement des modèles mammifères pour l’analyse des réponses sensori-motrices, tout en gardant une très grande pertinence du point de vue neuro-comportemental. Ainsi, nos données fourniront une base de données importante pour tester les modèles basés sur les circuits pour l’intégration sensori-motrice, la prise de décision et l’apprentissage multisensoriel-moteur et pour comparer l’architecture et la fonction des circuits neuronaux biologiques avec les implémentations in silico des réseaux neuronaux.

Les expériences de la procédure 2 ont lieu en milieu ouvert: les larves sont libres de nager dans une cuve et leur mouvement est suivi au moyen d’une caméra. Différents dispositifs permettent de soumettre la larve à des stimuli contrôlés (visuels, acoustiques, thermiques, vestibulaires) afin de déterminer sa réponse sensorimotrice. Une larve n’est utilisée qu’une fois par expérience, cette dernière dure entre 30 min et 3h. Pour les expériences des procédures 1 et 3-8, les larves (état vigile) sont immobilisées sous le microscope dans un gel d’agarose qui les tiennent autour du tronc du corps. Nous observons le comportement (mouvement des yeux et de la queue) spontané et évoqué par des stimuli physiologiques variés (vestibulaires, visuels, thermiques, acoustiques) avec une caméra. Simultanément, nous enregistrons de façon non-invasive via des méthodes optiques l’activité neuronale du cerveau entier. Une larve n’est utilisée qu’une fois par expérience, cette dernière dure entre 30 min et 3h. Pendant l’expérience de la procédure 3, certains neurones vont être activés ou désactivés de façon non invasive avec de la lumière. Avant les expériences de la procédure 4, nous injectons un ferrofluide biocompatible de façon uni- ou bilatérale dans les vésicules otiques des larves de poisson zèbre anesthésiées. Après un à deux jours de récupération, les larves (état vigile) sont immobilisées sous le microscope dans le gel d’agarose pour les expériences. Ici le ferrofluide sert de point d’accroche pour stimuler la perception vestibulaire et les mouvements corporels compensatoires grâce à un aimant placé sous le poisson. Pendant l’expérience de la procédure 5, des neurones individuels seront sélectionnés et ensuite ciblés pour une suppression rapide par ablation via un laser . Plusieurs jours avant les expériences de la procédure 6, nous allons enlever via une intervention chirurgicale sous anesthésie les deux yeux des larves. Plusieurs jours avant les expériences de la procédure 7, nous allons inactiver avec une intervention chirurgicale une oreille. Ceci sera réalisé en enlevant les otolites avec un embout de verre fin hors de la vésicule otique sur des larves anesthésiées entre 2 et 4 jpf. Avant les expériences de la procédure 8, nous allons enlever les cellules sensorielles de la ligne latérale par un bain de 2 heures dans une solution de sulfate de cuivre de faible concentration (10 μM/L).

Pour la procédure 2 aucun effet indésirable est attendu car les larves peuvent nager librement. Pour les procédures 1 et 3-8, les larves (état vigile) sont immobilisées sous le microscope dans un gel d’agarose. Cette méthode permet une oxygénation de l’animal par simple diffusion de l’oxygène à travers la peau. L’immobilisation n’induit pas de douleur mais éventuellement du stress. Toutes les expériences sont effectuées par du personnel formé en expérimentation animale, ce qui permet de garantir de limiter le plus possible le stress. Cela est capital pour le succès des expériences dont le but est de caractériser la réponse comportementale et neuronale sous les conditions les plus naturelles possibles. Toutes les interventions chirurgicales sont exécutées sous anesthésie et la bonne récupération des larves est surveillée au cours du temps pour assurer une bonne cicatrisation et l`absence d’inflammation.

Procédure 1 – 8: euthanasie. Pour des raisons de place et de coût, il ne sera pas possible d’amener l’ensemble des individus utilisés jusqu’à l’âge adulte. En milieu naturel, seule une toute petite proportion d’individus atteint l’âge adulte, ce qui signifie que si nous ne limitons pas artificiellement le nombre d’individus la population croît exponentiellement. Ainsi, seule une petite proportion de larves sera utilisée pour renouveler la population d’adultes. Les individus qui ne sont pas utilisés pour ce renouvellement seront utilisés pour les expériences, puis mis à mort à l’issue des procédures expérimentales.

Le poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’imagerie calcique des neurones. Son développement rapide, le grand nombre d’embryons synchronisés par la ponte et la diversité des lignées génétiquement modifiées disponibles en font un système de choix pour les neurosciences. La transparence et les dimensions réduites du cerveau à l’état larvaire en font un modèle pour étudier les réseaux neuronal à l’echelle du cerveau entier. Nous utiliserons des animaux adultes pour l’entretien des lignées. Toutes les expériences sur les animaux seront réalisées entre 6 et 14 jours après la fécondation (jpf). À cet âge, le cerveau est encore petit et peut être entièrement étudié par les méthodes optiques. En revanche, les systèmes nerveux moteur et sensoriel sont déjà en place et peuvent être analysés sans attendre le stade adulte (12 semaines).