Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 08/11/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-404660)
1 794 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une ou deux injections intramusculaires dans la patte et subissent jusqu’à 28 stimulations du test DAS, qui mesure l’écartement des orteils, pour optimiser trois candidats myorelaxants de la famille FTP-9xx avant un éventuel essai chez l’humain. Le porteur indique que les seules nuisances attendues sont la douleur des injections et le stress du test DAS. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires de coculture restent d’une pertinence « débattue » et ne reproduisent pas la diffusion du composé dans le muscle, et conclut à la nécessité du rat.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Cette étude a pour objectif d’optimiser les paramètres d’utilisation de ces candidats Lead (en particulier la formulation et la cinétique d’injection) pour le traitement des maladies la contraction musculaire. Au final, l’ensemble de ces données de caractérisation serviront de base à la conception d’essai clinique chez l’homme. Nous démontrerons les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisés en clinique. Ce projet expérimental d’optimisation concerne 3 produits d’intérêt de la famille FTP-9xx identifiés suite à nos travaux exploratoires.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. Ainsi, ce projet apportera les bénéfices suivants : – Traitement efficace plus rapidement. – Traitement efficace sur du long terme.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à : – Injection intramusculaire = 1 ou 2 injection(s) , durée 30 secondes / animal / injection – Pesée des animaux = maximum 8 pesée / animal => 30 secondes / pesée => 4 minutes / animal – Test du DAS = 30 sec / test DAS (environ 28 stimulation sur la durée de l’étude / animal) => 14 minutes / animal
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Dans ce projet, les seules nuisances attendues sont : – les douleurs associés aux injection (dans ce projet une ou deux injections intra-musculaire) – le stress associé au test du « DAS »
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. Nous avons testé cette possibilité lors du premier projet, malheureusement sans succès. Il est possible que les animaux ayant subi une série d’expériences (suivi d’une période de repos) se soient accoutumés au test DAS, et répondent différemment des animaux naïfs ; le poids plus important des animaux ré-utilisés peut également impacter négativement la réponse au test DAS.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Le test DAS nous permet au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.
2. Réduction
Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de Kruskal Wallis) ; Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.
3. Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. Au cours de cette étude, nous souhaitons continuer à limiter au maximum le stress des animaux. Pour cela : Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0,2,4,7 et 14 puis une fois par semaine si l’étude est plus longue). La procédure d’injection est réalisée avec deux opérateurs : un maintient l’animal puis le second réalise l’injection. Une fois l’animal bien maintenu, l’opérateur qui injecte vient piquer dans le tibialis cranialis avec un angle d’environ 30°, injecte doucement les 25µL du composé puis retire lentement l’aiguille (33G). L’animal est ensuite redéposé dans sa cage. Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. La salle de manipulation est intégralement nettoyée (paillasse et sol) avant toute injection. Nous veillerons à ce que toutes les conditions environnementales pour l’injection soient le plus propres possible. Dans le cadre des procédures, aucun signe clinique n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans l’étude princeps et la littérature. En effet lors de notre précédent projet, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à l’injection n’a été observé. Cependant, dans le cas où l’injection serait mal réalisée, les signes observés et les mesures mises en œuvre sont décrits dans le tableau fourni dans l’annexe. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire suivant le tableau fourni en annexe.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Le test DAS chez le rongeur, déjà éprouvé lors de notre étude princeps, est au contraire un test reconnu pour sa pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 10-12 semaines maximum en fin d’expérimentation (300g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler.