Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 11/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-422625)
98 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le cerveau, par une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes, des formes altérées d’une protéine liée à la maladie de Parkinson, pour comparer leur pouvoir pathogène. Le porteur indique que cette inoculation conduit irrémédiablement à une paralysie mortelle, les animaux étant tués dès l’apparition d’une démarche saccadée et d’une perte d’équilibre. Il affirme que le projet ne peut être mené qu’in vivo, faute de méthode alternative.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’alpha-synucléine est une protéine présente sous une forme anormale dans les lésions cérébrales des patients atteints de la maladie de Parkinson, la démence à corps de Lewy ou l’atrophie multisystématisée. Nous avons développé une méthode permettant d’amplifier in vitro les altérations de l’alpha-synucléine à partir d’un cerveau (substrat) provenant de souris conventionnelles C57Bl/6 après amorçage de la réaction par une petite quantité de matériel cérébral de souris modifiées génétiquement (M83) et présentant des altérations de l’alpha-synucléine humaine. Notre projet vise à évaluer dans quelle mesure la présence d’autres protéines humaines anormales dans le cerveau utilisé comme substrat peut modifier les altérations de l’alpha-synucléine lors de la réaction in vitro. Ces autres protéines humaines examinées sont celles impliquées dans la maladie d’Alzheimer (β-amyloïde et tau) et dans le diabète de type 2 (peptide amyloïde des ilots pancréatiques). Les caractéristiques de l’alpha-synucléine ainsi altérée in vitro sont évaluées dans notre projet par les caractéristiques de la maladie et des lésions cérébrales observées suite à son inoculation dans le cerveau de souris modifiées génétiquement (M83).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le projet vise à apporter des nouvelles connaissances sur les relations entre des protéines qui sont altérées dans la maladie d’Alzheimer ou le diabète de type 2 et l’alpha-synucléine, qui est altérée dans la maladie de Parkinson. Il est en effet établi que l’altération des premières protéines entraîne une fréquence accrue et une aggravation des maladies humaines associées à l’alpha-synucléine altérée, mais les mécanismes en cause restent encore très mal compris. Ce projet envisage de répondre à la question de savoir dans quelle mesure ceci peut être lié à des altérations différentes de l’alpha-synucléine elle-même, du fait de la présence dans le cerveau d’autres protéines altérées. On parle de co-morbidités.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les produits d’amplification obtenus in vitro sont caractérisés par leur pathogénicité après inoculation dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 98 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’inoculation de différentes formes altérées d’alpha-synucléine présentes dans les différents produits d’amplification étudiés est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie, et leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition des symptomes moteurs et à décrire l’extension des lésions et les altérations de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.
2. Réduction
Les 7 lots expérimentaux sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles, pour chaque produit d’amplification examiné. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée de survie, de la distribution des lésions cérébrales et des altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. L’analyse statistique de la distribution de l’alpha-synucléine nécessite en particulier un minimum de 6 souris au stade clinique de la maladie. Un lot de 14 souris nous permet ainsi de bénéficier au stade clinique d’au moins 6 cerveaux, pour les analyses biochimiques de l’alpha-synucléine et d’au moins 6 cerveaux pour l’analyse des lésions cérébrales. Les autres prélèvements (intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire dans ce modèle de souris sur les marqueurs de la maladie dans les tissus périphériques.
3. Raffinement
Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (igloos, nestlets ou sizzles) pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d’abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés selon les critères et le scoring prévu en annexe et justifiant la mise à mort de l’animal. Grâce à ce projet fondé sur l’inoculation de différentes sources d’alpha-synucléine anormale nous souhaitons affiner la caractérisation clinique comme possible critère de différenciation, une possibilité décrite dans la littérature scientifique, par exemple lors d’un test de suspension par la queue.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Plusieurs études récentes ont montré que les souris (M83) utilisées dans ce projet permettaient la caractérisation de différentes formes anormales d’alpha-synucléine, après leur inoculation dans le cerveau de ces souris, sur la base du délai d’incubation de la maladie, de l’extension des lésions dans le cerveau et des altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris âgées de 6 à 8 semaines. Compte-tenu de l’importance de la mesure de la durée d’incubation de la maladie ces souris sont entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à son apparition, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.