Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-10-23 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-470506)
66 roussettes vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces petits requins pêchés en mer sont soumis à des changements de salinité et de température pendant 24 heures avec quatre prélèvements sanguins, avant d’être tués pour disséquer leur moelle épinière et caractériser des cellules nerveuses, afin d’étudier l’adaptation des requins aux variations de leur milieu. Le porteur affirme que ces variations restent dans la gamme naturelle et n’attend de stress que lors des manipulations et des prises de sang. Il indique qu’aucune culture de ces cellules n’est possible faute de connaissances, et qu’il n’existe donc « pas d’alternative » in vitro.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Chez les poissons, comme chez les autres vertébrés, l’organisme adapte sa physiologie aux variations de son environnement grâce à la perception des fluctuations environnementales comme par exemple les variations de températures ou de lumière par son système nerveux central qui contrôle alors les sécrétions hormonales, notamment au niveau de l’hypophyse, qui régulent différentes fonctions biologiques. En plus du cerveau, il existe chez les poissons un système nerveux supplémentaire situé à l’extrémité caudale de la moelle épinière, appelé système neurosécréteur caudal. Ce système neurosécréteur caudal jouerait un rôle dans la coordination de différents processus physiologiques de l’organisme en réponse à des variations de salinité ou de température, comme montré récemment dans la littérature chez le flétan. Chez les requins, le système neurosécréteur caudal est constitué de neurones géants appelés cellule de Dahlgren. Bien qu’identifiées depuis longtemps, aucune étude récente n’a porté sur la caractérisation plus poussée de ces cellules. L’objectif du présent projet est d’analyser et de comparer les sécrétions hormonales des cellules de Dhalgren isolées à partir de roussettes adultes mâles qui auront été soumises à des changements de température et de salinités sur un temps court et dans le respect du principe des 3R.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’analyse de la réponse hormonale des cellules de Dahlgren chez des animaux soumis à des variations de température et de salinité nous permettra d’établir ou non si ces cellules peuvent jouer un rôle essentiel dans l’adaptation des requins aux contraintes environnementales liées au changement climatique. A plus long terme, les bénéfices susceptibles de découler de cette étude chez une espèce de requin largement abondante sont de différents niveaux : (1) apporter des connaissances sur un modèle de requin qui seront bénéfiques à la compréhension des capacités d’adaptation d’autres espèces de requins dont les populations sont en danger ; (2) comparer les résultats obtenus sous un angle de l’évolution des espèces et d’identifier ainsi des processus fondamentaux conservés ; (3) disposer de marqueurs hormonaux en tant qu’outil pour caractériser les capacités d’adaptation d’une espèce donné en fonction de son environnement et ainsi adapter cet environnement pour un meilleur bien-être dans le cadre de programmes de préservation d’espèces aquatiques ou d’élevages. L’absence de variations hormonales des cellules de Dahlgren posera la question d’un autre rôle de ces cellules et c’est pourquoi nous prélèverons, en fin d’expérimentation, un maximum de tissus biologiques chez un même animal pour explorer différentes fonctions physiologiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Des roussettes mâles adultes seront pêchées puis acclimatées dans des bacs de grande dimension alimentés avec de l’eau de mer naturelle à 15°C et sous un cycle de lumière artificielle 8L:16D correspondant aux conditions optimales décrites dans la littérature. Trois procédures dont les paramètres seront dans la gamme des conditions naturelles pour les requins, seront mises en place : (1) Test de salinité de 24h effectué sur 3 lots : 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer non diluée (100%) vers une eau de mer 100% (lot contrôle) ; 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer diluée (eau de mer à 80%) vers une eau de mer 100% ; 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer 100% vers une eau à 80%. (2) Test thermique de 24h effectué sur 3 lots : 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 15°C (contrôle) ; 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 10°C ; 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 20°C. (3) Test combinant les changements de température et de salinité et qui portera sur 5 lots, chacun de 6 animaux, sur une durée de 24h : eau de mer 100% vers 100% à 15°C; eau de mer 80% vers100% à 10°C; eau de mer de 80% vers 100% à 20°C; eau de mer 100% vers80% à 10°C; eau de mer de 100% vers 80% à 20°C. Pour l’ensemble des animaux, une série de 4 prélèvements sanguins à 0h, 6h, 12h et 24h après les transferts, de moins de 1mL et n’excédant pas, au total, 10% du volume sanguin de l’animal sera effectuée pour des analyses biochimiques. A la fin des expérimentations, les animaux seront mis à mort pour récupérer un grand nombre de tissus biologiques dont les moelles épinières pour la caractérisation des cellules de Dahlgren. Ces dernières seront analysées par des approches techniques hautement résolutives afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un minimum de cellules, et donc d’animaux, collectées.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les variations de température et/ou de salinité qui seront appliquées sont dans des gammes physiologiques et naturellement rencontrées par les requins, dont la roussette ; il n’y a donc pas de nuisance ou d’effet indésirable attendu sur la base de ces variations. Par contre, un stress et inconfort est attendu lors de la prise (manipulation) des animaux lors des transferts d’une condition à l’autre ainsi que lors des prélèvements sanguins. Ces derniers correspondent à un degré de sévérité de classe légère. Une acclimatation et une sédation sont envisagées.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Mise à mort pour prélèvement des cellules de Dahlgren en vue de leur caractérisation moléculaire et le prélèvement de différents organes pour analyser l’impact des variations de température et/ou de salinité sur différentes fonctions biologiques. Du fait de leurs localisations dans la moelle épinière, les cellules de Dahlgren ne peuvent être prélevées qu’après dissection.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’impact des variations environnementales sur la physiologie de ce requin sera abordé en ciblant les cellules de Dahlgren mais également en prélevant un nombre maximum de tissus biologiques chez un même animal afin d’avoir une analyse plus large et plus intégrée. L’accès à la veine caudale, dans laquelle les hormones des cellules de Dahlgren sont libérées, est facilement accessible et permettra une analyse des sécrétions dans le temps et évitera ainsi d’utiliser des animaux supplémentaires. L’utilisation de culture de cellules de Dahlgren n’est actuellement pas possible du fait, justement, de l’absence de connaissances sur ces cellules spécifiques et il n’y a donc pas d’alternative in vitro disponible. Cependant, les hormones identifiées au niveau des cellules de Dahlgren au cours de ce projet seront, par ailleurs, testées in vitro sur des lignées cellulaires pour étudier leur mode d’action.
2. Réduction
L’expérimentation in vivo est réduite à 6 animaux par condition expérimentale pour permettre une analyse statistique appropriée pour les faibles effectifs. Les variations testées de température et de salinité, la durée de l’expérimentation ainsi que les temps de prélèvement des échantillons sanguins ont été définis et réduits au minimum sur la base des données bibliographiques. Ces données ont notamment montré qu’une exposition de la petite roussette, ou d’une autre espèce de requin, dans un milieu de salinité différente provoquait une variation significative des paramètres plasmatiques à 6h et que la réponse de tissus biologiques impliqués dans l’osmorégulation était observée entre 12h et 24h après le changement de milieu. Les températures choisies correspondent à celle qui impacte (20°C) ou non (10°C) la spermatogenèse et à celle qui impacte (20°C) ou non (15°C) la croissance embryonnaire de la roussette. Ces températures correspondent également à une augmentation de 5°C des température moyennes de surface des océans dans les scénarios de changement climatique. Ces données bibliographiques nous ont donc permis de bien cerner les conditions à tester et d’éviter l’utilisation d’un nombre plus important d’animaux. De plus, l’utilisation de technologies performantes à haute résolution permet d’obtenir des données statistiquement analysables à partir de faibles quantités d’échantillons, ce qui permet de limiter le nombre de cellules de Dahlgren à prélever, et donc d’animaux. Un maximum d’organes sera prélevé sur un même animal pour des études ultérieures liées au projet et pour leurs utilisations dans des projets différents réalisés par d’autres chercheurs s’intéressant à cette espèce.
3. Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant au minimum 4 semaines avant les expériences dans des systèmes à flux ouvert avec de l’eau de mer naturelle à 15°C, sous un cycle de lumière artificielle 8L:16D et ils seront en groupe à raison d’une densité de 5 animaux / 100L (environ 35kg/m3). Cette période de 4 semaines est justifiée par une préconisation généralement admise de 2 semaines de délai entre le transport des animaux et leur inclusion expérimentale auxquelles sont rajoutés 2 semaines minimum qui permettront une manipulation des animaux (caresses du museau, caresses ventrales, prise en main dans les bacs, tests d’immobilité tonique). Au cours de cette période, les animaux seront nourris de poissons ou de mollusques ad libitum à une fréquence d’une fois par semaine, ce qui est en accord avec le mode d’alimentation des requins. Les animaux seront également pesés et mesurés puis identifiés par un marquage externe (fil de couleur placé autour du corps devant la nageoire dorsale). Lors des tests, les animaux seront transférés dans un bac de 100L (hauteur de 60 cm) permettant une nage sans contrainte et ainsi assurer une bonne irrigation des branchies et, selon les conditions, permettant également aux animaux de boire. Lors de ces tests une observation de comportements de stress (nage rapide et comportement de fuite hors du bassin, rougeurs de la peau) entrainera aussitôt l’exclusion des animaux. Pour les prélèvements sanguins les animaux seront transférés dans un bac de petite dimension (1m x 0.30m) pour permettre leur sédation et la mise en place d’une pompe buccale non invasive pour assurer l’irrigation des branchies. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour procéder aux prélèvements des tissus biologiques.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’espèce utilisée, Scyliorhinus canicula est un requin Carcharhiniforme non classé comme vulnérable (Least Concern) sur la liste rouge de l’UICN (Union internationale pour la conservation de la nature). Du fait de son abondance et de la disponibilité de données scientifiques, dont génomiques, cette espèce est considérée comme une espèce modèle pour l’étude des requins. Ces derniers appartiennent au groupe des poissons cartilagineux (Chondrichtyens) qui regroupe également les holocéphales (ou chimères) et les raies. Au cours de l’évolution, les poissons cartilagineux ont divergé des vertébrés osseux il y a environ 420 millions d’années. Ils constituent donc un taxon d’intérêt pour les études phylogénétiques. De plus, les études en physiologie des poissons s’intéressent très peu à celle des requins et des raies alors qu’ils constituent un groupe très différent des poissons osseux et qu’ils sont de plus en plus menacés dans nos écosystèmes marins. Seuls des animaux adultes de sexe mâle seront utilisés. Les roussettes mâles atteignent une maturité sexuelle à 6,6 ans pour une taille de 54 cm. Afin d’utiliser des lots homogènes, nous identifierons les animaux au préalable dans une gamme de taille de 60±3 cm et de poids de 680±30g. L’utilisation d’adultes est justifiée par le fait de prélever des animaux en milieu naturel qui aient eu des cycles de reproduction, donc moins impactant pour la ressource, et de disposer d’animaux de taille suffisante pour le prélèvement des échantillons biologiques.