Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/01/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-507247)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet vise à étudier des mécanismes responsables de l’apparition des douleurs neuropathiques, en particulier dans le cadre de neuropathies toxiques comme dans les traitements chimiothérapeutiques à la Vincristine. Ce projet est justifié par la mauvaise compréhension actuelle des mécanismes à l’origine de ces douleurs qui altèrent considérablement la qualité de vie des patients. Ce projet permettra d’étudier les réponses immunitaires mises en jeu, d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de faire le parallèle avec une étude clinique menée en parallèle chez les patients. Pour vérifier le rôle de certains acteurs, certaines molécules et inhibiteurs seront administrés à des souris traitées à la vincristine.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre laboratoire possède une expertise reconnue dans les modèles de développement de neuroinflammation chez la souris. Cette étude comparative, s’intéresse aux développements de neuropathies inflammatoires et toxiques, dont les mécanismes impliqués sont encore très mal compris. Nos résultats pourront améliorer nos connaissances pré-cliniques du développement de ces douleurs neuropathiques et permettront de transposer ces connaissances vers la clinique. Nous souhaiterions identifier de nouveaux biomarqueurs et permettre la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les humains.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les douleurs neuropathiques des animaux traités à la vincristine seront évaluées par des tests de la sensibilité tactile avec les filaments de Von Frey, de la sensibilité thermique avec la plaque chauffante et de la coordination motrice avec le rotarod. Chaque test sera réalisé 10 fois tout au long des 2 mois maximum de suivi de l’animal. Des mesures d’électro-neuromyogramme seront également réalisées par l’utilisation d’un dispositif de stimulation et de recueil dédié aux mesures électrophysiologiques. Pour cela l’animal sera maintenu endormi sous isoflurane et sur un tapis chauffant tout au long de la mesure. Les stimulations seront réalisées à des voltages progressifs de 4mV à 10mV. Les mesures seront brèves, 10 minutes par animal en intégrant l’installation des électrodes et les stimulations. Comme pour les tests comportementaux, les mesures électrophysiologiques seront réalisées 10 fois tout au long des 2 mois maximum de suivi des animaux.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le modèle de développement de neuropathies toxique (Vincristine) va conduire à des inflammations périphériques et centrales, associées à une atteinte des nerfs périphériques. Cette atteinte transitoire du SNP est responsable d’une modificatuin des sensibilités tactile et thermique, sans atteinte des capacités motrices. Ces symptômes des neuropathies, similaires à ceux observés chez l’Homme, se maintiendront environ 2 à 3 semaines après le début des injections. Aucune données de la littérature n’a démontré le niveau de stress des animaux durant cette période inflammatoire. Néanmoins, nous limiterons la manipulations des animaux au minimum durant cette période. Par la suite, les symptômes vont se résorber spontanément en une à deux semaines jusqu’à ce que les animaux retrouvent une sensibilité tactile et thermique normales.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Mise à mort des souris pour l’ensemble des 5 procédures. Pour chaque procédure, les souris utilisées en série 1 permettront la réalisation d’une étude comportemntale longitudinale, avec une mise à mort à la fin. Pour les séries 2 à 4, les souris seront utilisées pour la réalisation de prélèvements tissulaires à différents temps pertinents de l’expérience vis à vis des mécanismes cellulaires qui nous intéressent.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le modèle animal est fondamental afin d’étudier l’inflammation et la pathologie nerveuse (destruction des gaines de myéline, neuro-inflammation et infiltration cellulaire) au niveau de l’organisme entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. Dans le cadre de ce projet s’intéressant au développement des douleurs neuropathiques et mécanismes associés, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires périphériques et centrales et ses conséquences sur le système nerveux périphérique. Néanmoins, nous avons identifié récemment les neutrophiles comme cellules majeures du développements des douleurs neuropathiques, ces cellules sont actuellement isolées à partir de moelle osseuse de souris et/ou de sang total humain pour être cultivées et étudiées in vitro. Bien que les expériences in vitro soient utilisées dès que possible, aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et la communication cellulaire entre les différents acteurs de la réponse immunitaire. Actuellement, l’expérimentation animale est la seule alternative pour comprendre les interactions des systèmes nerveux/immunitaires et d’examiner la pathologie au niveau moléculaire, cellulaire et comportementale, aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou in silico.
2. Réduction
Notre objectif est de conserver une analyse statistique robuste tout en réduisant le nombre d’animaux par lot. – L’étude comportementale est l’approche qui nécessite le plus d’animaux afin de valider la significativité de nos résultats : le groupe de souris traitées comportera n=15 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux pour le groupe contrôle (souris naïves) à n=10. -L’étude par dosages immunologiques sera réalisée à différents temps stratégiques tout au long des 2 mois : des dates de prélèvements sont prévus afin d’obtenir un profil immunologique recouvrant toute la période d’expérimentation. Nous réduisons le nombre d’animaux par prélèvement à n=10 souris/groupe C57Bl6 et n=5/groupe KO. -L’étude histologique, comme pour les dosages, sera réalisée à différents temps de l’expérience : 8 points de prélèvements sont prévus afin de comprendre la dynamique histologique dans notre modèle. De même, nous réduisons le nombre de prélèvements à n=5 souris/chaque groupe. -L’étude d’isolement et caractérisation cellulaire par cytométrie en flux sera également réalisée à différents temps de l’expérience : 9 points de prélèvements sont prévus afin d’identifier des mécanismes cellules spécifiques. De même, nous réduisons le nombre de prélèvements à n=10 souris/groupe C57Bl6 et n=5/groupe KO. Pour comparer de manière pertinente les groupes expérimentaux souris contrôles vs souris traitées, une analyse statistique nous a permis de déterminer le nombre suffisant d’animaux à utiliser.
3. Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage à cap standard au nombre maximum de 6 souris par cage avec une période d’adaptation de 7 jours minimum, idéalement 14 jours. Nous disposerons dans les cages dès le début de l’expérience, deux types d’enrrichissement, l’un pour la réalisation du nid et le second pour satisfaire le besoin des souris de ronger. En accord avec la SBEA, nous ferons varier chque type d’enrichissement pour limiter l’habituation et l’ennui des animaux. Selon nos expériences antérieures, soutenues par les données de la littérature, les animaux injectés avec la Vincristine ne présenteront pas de phénotype de douleur comme la prostration, les poils hérissés et la paralysie. Nous ne prévoyons pas d’administrer des analgésiques car ils pourraient influencer et donc invalider les résultats expérimentaux. Par exemple, le paracétamol, l’aspirine ont un effet inflammatoire sur le foie notamment. La morphine n’est pas indiquée car elle induit une dépression de la fonction pulmonaire. La dexamethasone ou les médicaments non-stéroidiens de type inhibiteur de Cox2 ou de prostaglandine tels que l’ibuprofen ou le diclophenac interfèrent avec l’inflammation. Une grille de score clinique sera renseignée pour l’injection de la vincristine et une seconde grille pour les injections des modulateurs, afin d’évaluer les éventuels signes de souffrance (prostration, poils hérissés, perte de poids…). Selon nos expériences antérieures, soutenues par les données de la littérature, les animaux injectés avec la Vincristine ne présenteront pas de phénotype de douleur visible, avec une prise alimentaire normale et donc sans perte de poids. Les animaux seront mis à mort dès que le point limite sera atteint, soit un score de 2 pour l’un des critères, soit un score de 4 sur la somme des critères.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris de fond génétique C57BL/6 est un modèle reconnu dans le cadre des études des pathologies neurologiques. L’existence de nombreuses lignées transgéniques, dont les lignées cGAS ou STING -/- que nous utiliserons, et la disponibilité d’outils moléculaires spécifiques (eg. Anticorps spécifiques, sondes moléculaires…) ont apporté ces dernières années une meilleure compréhension des neuropathologies et ont conduit aux développements de nouvelles pistes thérapeutiques. Les animaux utilisés seront âgés de 8 à 24 semaines afin d’avoir un système immunitaire et un système nerveux matures et des comportements adultes.