Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 02/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-511904)
516 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est rasé, reçoit le produit sur la peau ou par injection intramusculaire, puis subit une dizaine de mesures électriques du muscle sous anesthésie et une trentaine de mesures de l’écartement des doigts de la patte. Le projet compare des produits commerciaux, désignés comme « nos produits », aux traitements de référence de la dystonie et de la spasticité. Le porteur indique que la réutilisation des animaux a été tentée sans succès et affirme que les modèles cellulaires restent débattus.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Cette étude a pour objectif de démontrer l’efficacité et les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisés en clinique. Dans cette étude, le produit sera administré localement aux rats, sur la peau d’un membre postérieur (application topique au niveau du tibialis cranialis). Nos produits seront comparés au traitement actuel de référence.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (FTP-501) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide, et d’autres offrent un effet durable par exemple (le cas du premier Lead FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Nous visons ainsi le développement de plusieurs produits, car nous envisageons la possibilité de positionner chacun des produits finaux pour le traitement de différentes maladies neuromusculaires.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Rasage : 1 fois : 30 sec/animal Administration composée : 1 fois : 1min / animal et maintient avec un pansement pendant 2h ; Mesure CMAP (avec anesthesie) : environ 10 fois : 15 min / animal = 150 min /animal (1h30) Mesure DAS : environ 30 fois : 10 sec / animal = 300 sec / animal (5 min)
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances attendues ici sont : Partie administration des composés : Stress dû au rasage de la patte des animaux, administration des composés par voie sous-cutanée ou intra-musculaire, légère gêne suite au pansement occlusif sur la patte. Partie observation : Stress dû aux lectures DAS (Digit Abduction Score = score de l’écartement des doigts de la patte) et au différentes anesthésies pour les mesures de CMAP (Coumpound Measurement Activity Potentiel = mesure de l’activité élétrique du muscle).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. Nous avons testé cette possibilité lors du premier projet, malheureusement sans succès. Il est possible que les animaux ayant subi une série d’expériences (suivi d’une période de repos) se soient accoutumés au test DAS, et répondent différemment des animaux naïfs ; le poids plus important des animaux ré-utilisés peut également impacter négativement la réponse au test DAS.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de co-culture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Les test DAS et CMAP nous permettent au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.
2. Réduction
Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.
3. Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’administration des composés (ici topique et intra-musculaire.) est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. Les administrations de nos composés en topique sous pansement occlusif ne seront réalisées qu’une seule fois sur un temps assez restreint (2h). Pour toutes les mesures de CMAP, les animaux seront anesthésiés environ 10 fois pour chaque animal (aux temps 2h, 4h, 8h, 24h, 48h, J7, 14J, 21J, 28J (et tous les 7 jours jusqu’au retour du signal au signal de départ)
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Les tests DAS et CMAP chez le rongeur, déjà éprouvés lors de notre étude princeps, sont au contraire des tests reconnus pour leurs pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles (Bien que faciles à manipuler, nous avons remarqué au cours de l’étude princeps que la prise de poids des animaux ne facilitait pas la stimulation et la lecture du DAS (animal difficile à stimuler, et peu enclin à exhiber un réflexe). Or il est largement admis que les mâles prennent plus de poids que les femelles. De plus, nos molécules ont été administrés en i.m (pour tester leurs efficacités dans notre étude princeps) et que nous n’avons remarqué aucune différence (entre mâles et femelles) de réponse pharmacologique. De plus, pour les molécules testées ici leur pharmacocinétique est connue (soit dans la littérature, soit testé dans notre laboratoire), et aucune différence significative n’est observée entre les deux sexes. Afin de diminuer notre variabilité de mesure, nous sommes donc contraints de nous limiter aux animaux femelles) âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler