Etude du remodelage structurel et fonctionnel de la barrière épithéliale digestive et de la barrière urothéliale après lésion médullaire dans un modèle murin

En France, les lésions de la moelle épinière représentent 10 à 80 cas/million d’habitants/an, soit environ 1000 nouveaux patients/an. Les troubles du transit après lésion médullaire sont majeurs, et notamment les troubles de motricité colique. Les troubles urinaires sont également invalidants. La compréhension de ces troubles apparaît comme un enjeu de santé majeur, et n’est pas faisable en tant que telle en recherche chez l’Homme. Nous avons malheureusement besoin d’un modèle animal de lésion médullaire chronique pour partir des troubles observés in vivo, et en faire le parallèle avec les troubles fonctionnels observables ex vivo. Lors d’une 1ère étude, nous avons soulevé le rôle de médiateurs lipidiques dans les processus physiopathologiques affectant à la fois les fonctions de la barrière intestinale et vésicale ainsi que le Système Nerveux Entérique (SNE). Parmi ces médiateurs, figurent les médiateurs lipidiques dérivés des acides gras. En effet, les dérivés d’acides gras polyinsaturés (AGPI), peuvent réguler une multitude de réponses cellulaires, notamment la croissance et la mort cellulaire, l’inflammation. Cependant, leur impact sur le SNE et les dysfonctionnements de la barrière intestinale et vésicale reste inconnu. Les objectifs de cette étude seront de développer un modèle murin de lésions médullaires chroniques et de tester l’effet de différents médiateurs lipidiques sur la barrière urothéliale et digestive. Ce projet sera réalisé en tenant compte du principe des 3R. Le nombre de souris a été réduit au minimum possible tout en permettant une analyse statistique fiable (Réduire). Afin de limiter toutes sources d’angoisse et de souffrance, la réalisation du modèle de lésion médullaire sera effectuée sous anesthésie générale et les animaux recevront de l’analgésique avant et après l’opération. Les souris seront conservées dans des cages de taille suffisante, et avec un accès libre à l’eau et à la nourriture. Le bien-être des souris sera surveillé quotidiennement, avec un remplacement de la litière et un enrichissement par frisottis, et en évaluant l’état général des animaux, et des points limites seront mis en place (Raffiner). La corrélation in vitro-in vivo n’étant pas satisfaisante, le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable dans notre étude et il n’y a pas d’alternative au Remplacement. Les expériences seront réalisées en plusieurs fois et ce projet nécessitera 416 animaux (souris C57Bl6) dont 32 souris de «réforme».

Plusieurs bénéfices sont attendus suite à ces expériences : – Démontrer les changements suite à une lésion médullaire haute, de la motilité et des fonctions de barrière dans des souris SCI (Spinal Cord Injury) par rapport à des souris contrôles -Identifier le rôle de dérivés de certains médiateurs lipidiques sur les fonctions de la barrière urothéliale et les processus associés (prolifération cellulaire, mort cellulaire, …) ainsi que leur implication suite à une lésion médullaire – Identifier les cibles moléculaires clés sous-jacentes à ces changements fonctionnels grâce aux tissus murins collectés à la fin des expériences

Lésion médullaire: Les animaux seront anesthésiés dans un 1er temps afin d’effectuer la lésion médullaire ; et cette procédure dure 15 minutes par animal ; au début de l’expérimentation. Les instillations de médiateur lipidique (ou de son solvant) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane, que ce soit par instillation transuréthrale ou par voie sus-pubienne sous contrôle échographique. Les souris seront anesthésiées 3 minutes au maximum ; à partir de J14 et 3 fois/semaine soit 6 fois au total. L’étude du transit colique, du transit total et de la perméabilité intestinale sont réalisées en même temps ce qui permet de limiter les manipulations. Les souris seront gavées au début. Il y aura un prélèvement de sang (15 µl ± 5 µl) pour la perméabilité intestinale. L’endroit de l’incision sera ensuite comprimé avec une compresse afin de stopper le saignement. Ces 3 techniques seront réalisées 2 fois au total ; à J7 et J21. Pour le transit colique distal, les souris seront anesthésiées très rapidement (1 min), le temps de mettre la bille dans le colon. Cette procédure sera réalisée à J8 et J22. Pour l’open field, les animaux seront placés individuellement au centre d’une enceinte carrée et leurs mouvements seront enregistrés. Nous effectuerons cette procédure 2 fois au total : à J8 et J25.

La lésion médullaire induit une mobilité réduite des animaux. Les souris ont les membres inférieurs paralysés mais peuvent toujours se déplacer. Il peut y avoir des risques d’infections urinaires et pour éviter cela, nous changerons la litière quotidiennement tout au long de l’expérimentation. Suite à la chirurgie, les animaux recevront du Metacam associé à de la buprénorphine pendant 3 jours afin de réduire au maximum la douleur. La période post-chirurgie est très importante et la responsable du projet ainsi que l’étudiant associé prêteront une grande attention au bien-être de l’animal : les souris seront observées 2 à 3 fois/jour les 3 premiers jours ; puis quotidiennement. Afin d’éviter une déshydratation de l’animal, nous lui injecterons du NaCl en s.c (200 ul) le soir de la chirurgie ainsi que les 2 à 3 jours suivants. Les animaux auront un accès à l’eau facilité par des tétines plus longes sur les biberons ainsi que des croquettes humides ajoutées quotidiennement dans la cage. Au cours du temps, il est possible de voir les animaux avec des « fécès accrochées à leur postérieur ». Si c’est le cas, les animaux seront nettoyés à l’aide d’une compresse imbibée de sérum physiologique.

Procédures 1, 2 et 3 : les procédures 1 et 2 serviront à la mise au point du modèle (cathétérisation transuréthrale ou instillation sus-pubienne) tandis que la procédure 3 sera la manip complète. Dans les 3 procédures, les animaux auront une chirurgie de lésion médullaire et ceci est classé en procédure sévère.

La souris présente un temps de transit idéal pour les études de motricité et de perméabilité in vivo. Les souris seront âgées de 6-8 semaines. A ce stade, les souris sont adultes et ont des fonctions digestives assez développées pour nos études.