Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 16/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-555610)
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est maintenue isolée en cages métaboliques sur des grilles pendant plusieurs jours, avec de l’eau acidifiée et des prélèvements sanguins pratiqués au coin de l’œil, une autre reçoit des injections quotidiennes puis des régimes déséquilibrés en ions, pour étudier une protéine rénale mutée dans une maladie rare, l’acidose tubulaire distale. Le porteur reconnaît que les prélèvements oculaires peuvent léser l’œil, que l’isolement et la contention en cage métabolique stressent les souris et que les régimes provoquent une aversion alimentaire et une perte de poids. Il affirme que la culture de cellules rénales ne peut fournir un système intégré équivalent, juge le recours aux souris « indispensable » et les met toutes à mort pour prélever leurs reins.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le rein contrôle la composition en ions et en eau de l’organisme. Cette fonction est rendue possible grâce à des cellules qui forment de longs segments en forme de tubes dans le rein. Il existe plusieurs types de cellules tubulaires qui ont chacune des fonctions particulières. Certaines cellules appelées cellules intercalaires sécrètent des acides dans l’urine en formation. Ces dernières sont importantes lorsque l’organisme est surchargé en acide comme dans plusieurs situations : diabète, régime riche en protéines, troubles du métabolisme. Le nombre des cellules du canal collecteur varient en fonction des apports en ions. Cette augmentation a un rôle important puisque son défaut entraine une perturbation de la régulation de l’état acido-basique pour autant sa régulation n’est pas bien comprise. Ce projet propose d’étudier le rôle d’une protéine située sur la surface des cellules intercalaires. Elle est mutée chez des patients atteints d’une maladie rare : l’acidose tubulaire distale qui peut conduire jusqu’à de sévères atteintes rénales et un trouble de la composition en ions du sang. Le gène muté chez les patients sera invalidé chez la souris permettant d’avoir un modèle d’étude pour cette maladie rare. Le projet aura aussi pour objectif de déterminer l’importance de protéines membranaires pour la sécrétion acide par le rein et le comportement des cellules intercalaires. Il n’existe pas de modèle alternatif de cellules intercalaires en culture au laboratoire qui reproduisent l’ensemble des cellules tubulaires du canal collecteur. Ce projet nécessite l’utilisation de souris dont la composition cellulaire rénale est proche de l’homme. Nous mesurerons la fonction du rein chez ces souris ainsi que le contenu en ions du sang de ces animaux. La composition cellulaire des reins de ces souris sera également explorée.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les régulations de la sécrétion acide et du nombre de cellules permettant cette sécrétion sont mal connues. Pourtant, elles jouent un rôle fondamental dans le maintien bien équilibré d’un organisme pour son contenu en eau et en ions, pour le maintien du pH sanguin et une pression artérielle constante. Ce projet permettra de mieux connaitre certains mécanismes du rein qui sont modifiés lors de maladies comme l’hypertension ou de troubles métaboliques comme le diabète. Plus spécifiquement, il permettra d’établir un lien formel entre des mutations observés chez des patients et l’acidose tubulaire distale. Il permettra également de développer un nouveau modèle de maladie rare rénale.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour étudier la fonction rénale et la sécrétion acide, 80 souris seront installées individuellement dans des cages spéciales (cages à métabolisme) sur 2 périodes de 7 jours consécutifs permettant de récolter leurs urines. L’eau de boisson des souris sera acidifiée pendant 17 jours permettant de solliciter les cellules intercalaires rénales. Trois prélèvements sanguins avant et après le traitement acide pour chacune de ces 80 souris permettront de mesurer les concentrations en ions du sang. Ces prélèvements durent environ 10 secondes sont réalisés sous anesthésie locale. Un autre lot de 112 souris exprimant une molécule fluorescente qui doit être induite par une molécule chimique injectée aux animaux quotidiennement pendant 5 jours. Une fois la molécule fluorescent induite, les souris subiront différents traitements dans la nourriture ou la boisson pendant 3 à 15 jours perturbant certains équilibres ioniques de l’organisme.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Des prélèvements sanguins sont nécessaires et seront réalisés au coin de l’œil ce qui peut être entrainer un risque de lésion ou d’inflammation dans la zone autour de l’œil et entrainer une douleur. Certaines souris seront maintenues en cages métaboliques ce qui peut provoquer un inconfort car elles sont maintenues sur une grille pendant plusieurs jours. La cage métabolique étant transparente, les souris ne sont pas à l’abri de la lumière ce qui peut provoquer un stress car cette espèce évite la lumière directe. De plus, l’hébergement dans ces cages se fait de manière individuelle en isolant chacune des souris ce qui peut provoquer un stress car leurs contacts sociaux sont diminués. Dans la cage à métabolisme, l’administration d’un traitement acide dans l’eau de boisson entraine une modification transitoire du pH sanguin qui pourrait provoquer un inconfort à l’animal. Une molécule est injectée à certaines souris et cela implique que les souris soient contraintes pour effectuer l’injection. L’injection induit un stress et une douleur au point d’injection. Une modification des apports en ions dans la nourriture lors des procédures expérimentales sera effectuée. Elle peut provoquer une aversion transitoire pour la nourriture et entrainer une perte de poids chez les souris.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer les tissus (reins) et d’en analyser le contenu en cellules et de quantifier l’abondance de plusieurs transporteurs ioniques.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les modèles de cellules rénales en culture ne permettent pas d’obtenir les informations souhaitées ; ce projet nécessite un systèmes intégré multi-cellulaire reproduisant fidèlement le canal collecteur. Ce modèle n’existe pas à l’heure actuelle. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable. De plus, nous avons besoin dans ce projet de deux souches de souris génétiquement modifiée. Une première souche permettra d’étudier l’inactivation d’un gène retrouvé chez des patients atteints d’une maladie rare. Une deuxième souche permettra de suivre le devenir de cellules rénales en y exprimant une molécule fluorescente. Ces expériences ne sont pas envisageables dans un modèle plus simple tel que la culture de cellules.
2. Réduction
Dans toutes les procédures, le nombre d’animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Pour les mesures du contenu sanguin en ions, les protocoles ont été élaborés pour réduire au minimum le volume de sang prélevé et ainsi faire trois mesures sur les mêmes animaux à 2 semaines d’intervalle entre chaque mesure. Cela permet de réduire le nombre total de souris d’une procédure. L’administration du traitement acide dans l’eau de boisson et l’utilisation des cages à métabolisme pour mesurer la fonction rénale ont été déjà validées par plusieurs publications permettant d’anticiper parfaitement le nombre souris minimum nécessaire au projet. Le nombre de souris a également été calculé pour détecter des différents significatives entre les différents mesures histologiques et biochimiques faites sur les reins prélevés après mises à mort des animaux. En évitant d’avoir un groupe contrôle pour chaque groupe de traitement, nous avons également put réduire le nombre de souris à utiliser.
3. Raffinement
Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée (au moins trois fois par semaine). En cas de perte de poids importante, un aliment hydraté sera proposé aux souris Pour la mesure des concentrations ioniques dans le sang, le prélèvement sanguin (90µl) sera fait sur souris vigiles avec un collyre anesthésiant et sera confié à une personne qualifiée et expérimentée pour ce type de prélèvement. Le prélèvement sera de 90µl et correspond à un faible volume par rapport au volume de sang total d’une souris. Le protocole d’utilisation des cages à métabolisme comporte un suivi quotidien des animaux avec une mesure du poids, de quantité de nourriture ingérée et du volume d’eau bue tous les jours. Avant les mesures, une période d’habituation à la cage est réalisée. En plus, une habituation à la nourriture en poudre est réalisée. Un enrichissement (cylindre en plastique opaque) est également proposé permettant à l’animal de se mettre dans un endroit à l’abri de la lumière. Le séjour dans les cages à métabolisme a été réduit au minimum.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation du rein très semblable au rein humain. Nous savons également que la protéine participant à la sécrétion acide dans le rein et qui sera étudié dans ce projet est présente dans les mêmes cellules chez l’homme et la souris. L’organisation des cellules rénales est également identique chez l’homme et la souris. Les souris utilisées dans ce protocole seront des souris adultes car le projet porte sur l’étude de la fonction rénale d’un organisme adulte.