Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 10/07/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-558573)
4 085 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tuées pour la quasi-totalité, une partie dès le sevrage parce qu’elles ne portent pas le génotype recherché. À dix jours, chacune subit le prélèvement d’un millimètre de queue pour génotypage. Les souris retenues reçoivent ensuite un produit par injection intrapéritonéale ou par gavage, une fois par jour pendant quatre à cinq jours, puis passent trois tests comportementaux étalés sur trois semaines, portant sur l’intérêt social, la coordination motrice et la mémoire. Le porteur indique que le rôle de la protéine étudiée a déjà été caractérisé sur des cellules en culture, et conclut qu’il est « essentiel » de passer à l’animal pour observer la myéline en place et mesurer l’effet sur le comportement.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière), les neurones communiquent sous forme d’influx électrique, appelé influx nerveux, transporté le long de leurs axones. Afin d’assurer le bon acheminement de l’information nerveux, la formation de gaines isolantes autour de l’axone est essentielle. Ces gaines sont nommées ‘gaines de myéline’. Elles sont formées par des cellules appelées les ‘oligodendrocytes’ et permettent donc de moduler la vitesse de conduction de l’influx nerveux afin que les messages transmis dans le cerveau se déplacent de façon coordonnée. L’objectif de ce projet est de permettre la compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant la formation des gaines de myéline. La myéline étant une structure modulable tout au long de la vie, l’identification de cibles moléculaires permettant d’actionner cette dynamique au cours du développement et chez l’adulte, représente un espoir thérapeutique très important dans plusieurs pathologies de la myéline. Il a été démontré qu’une protéine, que nous appellerons protéine A, exprimée dans l’oligodendrocyte, contrôle la formation de la myéline dans des oligodendrocytes mis en culture. Nous souhaitons donc étudier en profondeur le rôle de cette protéine dans le déclenchement de la formation de la myéline chez l’animal, in vivo, au cours du développement et à l’âge adulte.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
A terme, l’étude approfondie du rôle de la protéine A dans le contrôle de la myélinisation au cours du développement et à l’âge adulte et de la remyélinisation permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la formation de myéline. En effet, en identifiant les conséquences de la suppression de l’expression de la protéine A dans les oligodendrocytes sur la formation de la myéline, nous apporterons une meilleure compréhension de comment est régulée la formation de la myéline.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Afin de connaitre le génotype des animaux générés pour cette étude (animaux dont trois gènes ont été modifiés pour supprimer l’expression de la protéine A dans les oligodendrocytes à l’âge adulte), un petit bout de tissu de 1mm sera prélevé sur chaque souris, une seule fois au niveau de la queue. Ce geste sera effectué sur des souris âgées de 10 jours (moins d’une minute par animal). De jeunes souris en développement ou adultes seront injectées par voie intrapéritonéale (dans le péritoine au niveau du ventre) ou administrées par voie orale par gavage (avec un produit conçu pour induire la délétion de la protéine A dans les oligodendrocytes), une fois par jour pendant quatre ou cinq jours consécutifs maximum, 1-2min/animal. Les tests comportementaux auxquels seront soumises les souris (pour apprécier l’intérêt social, la coordination motrice et la mémoire/flexibilité cognitive) sont non invasifs et seront effectués du moins au plus stressant, espacés d’une semaine entre chaque test. Chaque test dure au maximum 1 heure, entre le moment où la souris est sortie de sa cage et le moment où elle y retourne. Les animaux seront soumis à 3 tests comportementaux étalés sur une durée de 3 semaines. Le 1er test sera réalisé une fois par jour pendant 5 jours, chaque animal réalisera 3 essais, et le test durera 1h par animal maximum. Une période de repos de 3 jours sera respectée avant de commencer le 2ème test qui sera réalisé 1 fois par jour pendant 3 jours consécutifs (maximum 5 jours. Une période de repos de 3 jours sera respectée avant de commencer le dernier test composé de trois jours d’apprentissage et un jour de test (total 4 jours). Le placement de l’animal dans l’espace de test peut être une source de stress. En fin d’expérience, les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux âgés de 10 jours ressentiront une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité de la queue pour connaitre leur patrimoine génétique (1mm de tissu).Un stress et/ou douleur de courte durée peut être observé chez les souris à la suite de la contention (prise de la souris dans la main de l’expérimentateur) et à l’injection d’un produit permettant d’induire la délétion de la protéine A dans les oligodendrocytes en intrapéritonéal (piqure) ou par gavage (avec une paille en métal ou en plastique). Ce traitement aura lieu quotidiennement pendant cinq jours. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress pour les animaux : nouvel environnement et manipulation.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire : – Soit au moment du sevrage puisqu’ils ne seront pas porteurs du génotype d’intérêt. Soit à des fins expérimentales nécessitant le prélèvement des cerveaux pour une étude structurelle et développementale de la myéline (A noter que lorsque cela est possible, les animaux non porteurs du génotype d’intérêt seront proposés aux autres équipes de recherche de l’institut.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La gaine de myéline est une structure en trois dimensions : c’est une extension de la membrane de l’oligodendrocyte qui s’enroule autour d’un axone (bras du neurone). Suivant le principe de remplacement, le rôle de la protéine A a bien été caractérisé sur des cellules mises en culture. Cependant, il est essentiel dans le cadre de cette étude, de passer par une étude in vivo afin de pouvoir observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le système nerveux central et surtout l’activité électrique des neurones. De plus, afin d’évaluer les conséquences fonctionnelles et physiques, nous voulons analyser l’impact sur le comportement cognitif de l’animal.
2. Réduction
Nous optimiserons l’utilisation de nos animaux (4085). En raison de l’inclusion de l’élevage et des aléas inhérents aux aspects zootechniques et au fait que nous étudions séparément les mâles et les femelles (la répartition des naissances n’étant pas contrôlable et pas toujours équivalente entre les deux sexes), notre calcul d’effectif doit comprendre une marge. Nous produirons et utiliserons uniquement le nombre strictement nécessaire d’animaux pour générer les lots expérimentaux. Toutes les expériences mentionnées seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d’évaluer la présence éventuelle d’un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle. Nous travaillerons en étroite collaboration avec des statisticiens pour définir toutes les tailles d’échantillons et les tests statistiques appropriés.
3. Raffinement
L’animalerie est agréée : les conditions d’hébergement (stabulation en portoirs ventilés dans des conditions de température, hygrométrie, éclairage et espace maintenus dans les références recommandées) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (matériel de nidification et à ronger adaptés aux besoins des aniamux), d’alimentation et soins quand nécessaires seront contrôlés. Une période d’habituation à la manipulation par l’expérimentateur d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale. Toutes les injections seront faites par des personnes compétentes. Des points limites sont mis en place et respectés pour éviter toute souffrance. Les animaux seront observés quotidiennement par l’équipe de zootechnie et deux fois par semaines par notre équipe, pesés régulièrement au cours de leur procédure. Si les animaux présentent des signes de souffrance (plaie, amaigrissement, posture anormale, poil non soyeux, prostration, signes de douleur, zone d’injection gonflée ou indurée, petits exclus de la nichée, non pris en charge par sa mère), l’avis du vétérinaire référent sera immédiatement demandé et les traitements nécessaires seront appliqués. Si besoin pour éviter toute souffrance, l’animal pourra être euthanasié.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La formation de myéline est propre au développement des animaux vertébrés. Ainsi son étude nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. De plus, puisque nous étudions l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes recherchés présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. Dans un premier temps, nous avons choisi d’induire la délétion de la protéine A très tôt au cours du développement (à partir du jour 1 ou 14 post-naissance). Ainsi nous pourrons étudier dans le temps les conséquences de la perte de la protéine A dans les oligodendrocytes sur la formation de la myéline au cours du développement. Nous avons pour cela choisi 5 stades à étudier : 21 jours de vie et 30 jours de vie (différenciation oligodendrocytaire et myélinisation intenses), 60 jours de vie (jeunes adultes, fin du développement), 120 et 180 jours de vie (souris adultes âgées). Un âge avancé nous permettra de vérifier les modifications de la myéline induites par la modification génétique. Dans un second temps, nous induirons la délétion de la protéine A à 60-90 jours de vie, donc chez l’adulte, un stade où le paysage myélinique est globalement formé. Ainsi, nous pourrons évaluer l’impact sur la myéline de la perte de la protéine après 1, 2 et 3 mois post-induction du modèle afin d’évaluer si les voies protéiques contrôlées par A sont indispensables au maintien des gaines dans le temps, mais également les conséquences sur le comportement des souris.