Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 04/11/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-559190)
46 veaux non sevrés vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque veau subit un unique prélèvement de moelle osseuse au sternum sous anesthésie générale, d’une durée d’environ vingt minutes, avant d’être mis à mort. Le porteur indique choisir de jeunes veaux car la proportion de cellules souches diminue avec l’âge, et justifie l’anesthésie par le confort de l’animal et des manipulateurs. Il affirme qu’il n’existe pas d’alternative in vitro pour obtenir ces cellules bovines, l’objectif étant à terme d’établir une lignée cellulaire pour s’affranchir de l’animal.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Anaplasma phagocytophilum est une bactérie intracellulaire stricte (se développant dans les cellules), majoritairement transmise par les tiques. En Europe, c’est une bactérie d’importance économique majeure, notamment dans les élevages bovins où elle provoque des avortements. In vivo, cette bactérie infecte une catégorie de globules blancs mais qu’il n’est pas possible de maintenir en culture ou de cultiver sur le long terme. In vitro, les souches humaines et les souches équines et canines peuvent être maintenues en culture au sein de cellules de moelle osseuse immortalisées humaines ou de tiques. En revanche, les souches infectant les ruminants ne peuvent actuellement être cultivées que sur cellules de tiques. Or les cellules de tiques se divisent lentement et supportent mal les techniques de conservation par le froid, ce qui représente un obstacle à leur utilisation pour la culture bactérienne. De plus elles ne permettent pas d’étudier les interactions entre A. phagocytophilum et la cellule hôte des vertébrés. L’absence de lignées de cellules de moelle osseuse bovines limite aussi l’étude des facteurs responsables de la spécificité de souche pour certains hôtes vertébrés. Il est donc nécessaire d’établir une lignée cellulaire immortalisée de moelle osseuse in vitro pour la culture des Anaplasma infectant les bovins. L’utilisation de lignées cellulaires présente de nombreux avantages, elles permettent notamment de s’affranchir de l’obligation de réaliser régulièrement des prélèvements pour renouveler les cultures, ce qui leur confère aussi un intérêt en terme de bien-être animal. Une fois établies, les lignées sont composées d’une population cellulaire homogène permettant une standardisation des conditions de culture et des expérimentations pour une meilleure répétabilité.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Bénéfices à court terme : Cette étude conduira au développement d’une lignée de cellules permettant la culture des souches bovines d’une bactérie ne poussant que dans des cellules, A. phagocytophilum. Ce projet aboutira au dépôt de la/des lignée(s) cellulaire(s) dans une banque de cellules. Bénéfices à long terme : A plus long terme, comprendre les interactions entre la bactérie et les cellules bovines pour développer des moyens de lutte sanitaire ciblés contre cette bactérie dans les troupeaux de bovins. Ces cellules pourront aussi être utilisées par la communauté scientifique pour réduire certaines expérimentations in vivo dans d’autre domaines (autres agents pathogènes ou études de toxicité par exemple). Les techniques mises en œuvre dans ce projet pourraient aussi être appliquées à d’autres espèces animales pour lesquelles une lignée cellulaire n’est pas encore disponible alors qu’elle pourrait présenter un intérêt pour l’étude des interactions mammifère-A. phagocytophilum ; c’est le cas des cervidés sauvages.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les veaux prévus pour ce projet auront un unique prélèvement de moelle osseuse au sternum sous anesthésie générale et locale. La procédure dure au totale environ 20 min.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Possibilité de douleur ou stress pour l’animal : La ponction de moelle osseuse est un acte réalisé sur animal sédaté le plus souvent, avec ou sans anesthésie générale en pratique vétérinaire, l’animal étant en box de contention et/ou immobilisé à l’aide de cordes ou en décubitus latéral si le format de l’animal le permet. Par souci de confort et de sécurité pour l’animal et pour les manipulateurs, pour ce projet, la ponction sera réalisée sur animal anesthésié.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les veaux seront mis à mort en fin de procédure pour retour dans le circuit pédagogique.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Actuellement, il n’y a pas de méthode in vitro permettant la culture les souches de ruminants d’Anaplasma phagocytophilum et l’étude des intéractions hôté vertébré – agent pathogène. Le but de ce projet est in fine de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants pour la culture d’A. phagocytophilum et pour l’étude des interactions hôte vertébré – agent pathogène. Le tissu hématopoïétique est très sensible d’une part à l’hypoxie (en cas de mort de l’animal) et aux médicaments, ce qui nous interdit le recours à des cadavres d’animaux tout juste décédés. Notre but est d’obtenir le plus de cellules souches hématopoïétiques possible pour pouvoir attendre de ce projet qu’il soit fructueux.
2. Réduction
Ce projet nécessite l’optimisation de protocoles utilisés en médecine humaine, en particulier pour les étapes de prélèvement de moelle osseuse, de purification puis de culture des cellules souches hématopoïétiques et enfin d’immortalisation de ces cellules. Chaque animal ne sera prélevé qu’une seule fois et nous estimons que nous aurons recours à un maximum de 46 veaux. La moelle des individus jeunes étant beaucoup plus riche en cellules souches hématopoïétiques que celle des adultes le nombre de veaux impliqués dans cette étude sera plus faible que si ce projet était réalisé avec des animaux adultes. Il est aussi possible que la souffrance occasionnée soit moindre chez les veaux que chez les adultes, les prélèvements étant plus aisés à réaliser. Les personnes impliquées dans les étapes d’isolement des cellules souches hématopoïétiques, leur culture et leur immortalisation vont être formées pour maximiser nos chances de réussite. Une étude préliminaire visant à déterminer si les outils utilisés pour immortaliser les cellules humaines peuvent fonctionner sur des cellules bovines. A chaque étape d’optimisation du protocole, le nombre d’animaux utilisés pour l’étape sera contrôlé. Les prélèvements de bonne qualité après optimisation de l’étape n seront utilisés pour débuter les essais d’optimisation de l’étape n+1.
3. Raffinement
Les veaux auront un hébergement collectif, par 2, sur copeaux, respectant une alternance jour/nuit (12h/12h). Il seront nourris au seau avec du lait artificiel. Pour réduire au maximum les nuisances au bien-être animal lors des procédures expérimentales, chaque individu ne sera prélevé qu’une seule fois, sous sédation et anesthésie générale. Les animaux seront immobilisés pour éviter leur chute lors de la sédation ou lors de l’anesthésie. Pour prevenir une hypothermie, les animaux seront placés sur tapis chauffant. La totalité de la procédure prendra au maximum 20 minutes incluant environ 5 minutes pour le prélèvement de moelle. Les animaux seront mis à mort immédiatement après le prélèvement. Si pendant l’anesthésie les animaux montrent des signes cliniques d’hémorragie ou de défaillance cardiaque ils seront immédiatement mis à mort.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Il n’y a pas d’alternative à l’utilisation de bovins (Bos taurus) pour l’obtention de cellules souches myéloïdes de cette espèce animale. Les veaux sont des jeunes non-sevrés (1 à 1.5 mois, 40 à 70 kg). Le choix de collecter de la moelle osseuse sur des veaux à ce stade de développement est basé sur deux raisons : – La raison principale a trait au fait que la proportion de cellules souches dans la moelle diminue drastiquement avec la croissance et l’âge des animaux (sur la base des données humaines et vétérinaires disponibles). En effet, au fur et à mesure de la croissance, une partie de la moelle est remplacée par du tissu graisseux, limitant la quantité totale de cellules que l’on pourrait obtenir. Notre but étant d’obtenir un maximum de cellules souches pour les transformer, notre choix s’est porté sur des veaux plutôt que des bovins adultes pour ne pas multiplier les prélèvements chez des animaux adultes tout en maximisant nos chances d’obtenir une grande quantité de cellules souches à transformer. – La seconde raison porte sur l’ossification au cours de la croissance des animaux qui rend inaccessibles, chez les bovins certains sites de prélèvement intéressants pour ce projet, puisque riches en moelle.