Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 20/01/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-562583)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les myopathies centronucléaires (CNM) sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints. Aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Récemment dans la littérature, il a été décrit que le gène X, présent au niveau du muscle et du coeur et codant pour une protéine X jouant un rôle clé dans la contraction musculaire, a été identifié comme étant responsable de certains cas de myopathies centronucléaires. Il a été montré également qu’une diminution de la quantité de la protéine Y améliore les signes cliniques musculaires chez la souris ayant un déficit en protéine X (X-déficiente). Cependant, l’amélioration de l’espérance de vie et des signes cliniques cardiaques restent limitée chez ces souris. L’objectif du projet consiste à valider une preuve de concept selon laquelle une augmentation de l’expression d’une autre protéine, protéine Z, pourrait restaurer les signes cliniques cardiaques de la souris X- déficiente. Cette stratégie de thérapie où la surexpression d’une protéine peut compenser les effets négatifs liés à une mutation d’une autre protéine a déjà montré son efficacité dans la littérature. Pour vérifier notre hypothèse, nous souhaitons réaliser des croisements génétiques de souris afin d’obtenir des souris déficientes en protéine X et surexprimant la protéine Z humaine. Si une amélioration des signes musculaires et cardiaques ainsi qu’une augmentation de l’espérance de vie sont observées, la mise en place d’une thérapie génique sera conduite par la suite dans le modèle de souris X-déficiente.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène X.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Concernant les tests liés au phénotype musculaire : – Test de suspension : Mesure de la force du corps. -Test d’agrippement : Mesure de la force des pattes -Test de performance Rotarod : Mesure de la coordination motrice, l’équilibre, l’endurance et la résistance à la fatigue. -Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA): Les souris seront totalement anesthésiées pour qu’il n’y ait pas de réponse à la stimulation tactile (injection intrapéritonéale, deux injections) pendant maximum 1 heure. Concernant les tests liés au phénotype cardiaque: Les animaux seront soumis à une anesthésie sans intervention chirurgicale d’une durée de 20 minutes pour réaliser l’échographie et l’électrocardiogramme.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Selon les travaux issus de la littérature, les souris X-déficientes présentent une faiblesse musculaire et cardiaque aux âges étudiés. Dans cette étude, un nouveau modèle de souris X-déficiente sera étudié et des tests seront effectués pour confirmer le même profil observé dans la littérature. Les nuisances ou effets indésirables attendus causés par le retrait de la protéine X dans le modèle de souris X-déficiente sont les suivants : – Les animaux X- déficientes vont avoir une diminution de la motilité à 6 semaines de vie ainsi qu’une diminution de la contractilité musculaire à 13 semaines de vie à cause de la faiblesse musculaire dû à une perte de fonction de la protéine X. Au niveau cardiaque, à 6 semaines, elles vont développer une anomalie cardiaque qui va entraîner comme conséquence une diminution de la fonction cardiaque. Une diminution de la taille de la souris ainsi que du poids seront observées dès la sixième semaine. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests sont les suivants : -Pour le test de suspension et le test d’agrippement, la souris peut subir un léger stress. -Pour l’électrocardiographie, les souris peuvent avoir une bradycardie liée à l’anesthésie. La température sera contrôlée par une sonde rectale sur la plateforme de l’échographie tout au long de l’expérience. -Pour l’échographie, le thorax des souris sera rasé, et des électrodes seront insérées en sous cutané pendant l’électrocardiogramme, ce qui peut également entraîner un stress de courte durée -La mesure des propriétés contractiles musculaires est également réalisée sous anesthésie, pouvant provoquer une sécheresse oculaire au réveil. Concernant le perçage d’oreille des animaux à partir du 14ème jour après la naissance pour leur identification couplée au génotypage, ces animaux peuvent ressentir une douleur de courte durée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. Le phénotype cardiaque étudié est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part de mieux comprendre une activité essentielle de la protéine défectueuse dans cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype musulaire pathologique ne se développerait pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
2. Réduction
Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Un nombre minimum de souris sera également utilisé pour évaluer les dommages liés à cette lignée, à savoir 20 souris par groupe (mâles et femelles sauvages, mâles et femelles porteuses de la mutation). Les résultats obtenus des deux cohortes (souris sauvages et souris X-défcientes) seront utilisés pour deux procédures, ce qui permet une réduction du nombre de souris.
3. Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Afin d’évaluer et de mieux comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène X, nous avons besoin de réaliser des expériences physiologiques in vivo. De plus, cette nouvelle lignée mutante nous permettra de mieux comprendre un des rôles clé dans la maladie musculaire. Les symptômes de faiblesse musculaire et cardiaque liés à cette mutation apparaissent relativement tôt c’est à dire vers 6 semaines et d’autre part, nous souhaitons suivre l ‘évolution de cette maladie. Les tests pour évaluer les signes musculaires et cardiaques ne peuvent pas ête réalisées sur d ‘autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure du muscle y serait trop différente. La souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser ces expériences.