Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 02/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-574765)
84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent par chirurgie stéréotaxique une inoculation cérébrale de trois formes d’alpha-synucléine agrégée, dont des extraits de cerveau de patient, pour comparer la maladie induite dans un modèle de Parkinson. Le porteur indique que l’inoculation conduit à une démarche saccadée et une perte d’équilibre, et que les souris sont mises à mort dès ces premiers signes pour éviter une paralysie du train postérieur. Il affirme que le projet « ne peut être réalisé qu’in vivo » et qu’aucune méthode alternative n’existe aujourd’hui.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le but du projet est de comparer les caractéristiques de la maladie induite par trois formes d’alpha-synucléine de structures différentes au cours de passages successifs par inoculations dans un modèle de souris modifiées génétiquement. L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions des maladies humaines associées (maladie de Parkinson et démence à corps de Lewy, atrophie multisystématisée), au sein desquelles elle se présente sous une forme agrégée. L’étude implique la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine agrégée, ainsi que la localisation et l’étude morphologique des dépôts de cette protéine dans le cerveau des souris.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et des caractéristiques moléculaires observées lors de la maladie chez les souris.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris modifiées génétiquement (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 84 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’inoculation d’extraits cérébraux des souris malades contenant l’alpha-synucléine agrégée, de trois origines distinctes (fibre synthétique, cerveau de souris modifiée génétiquement malade, cerveau de patient humain), est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie. Leur mise à mort est ainsi réalisée dès l’apparition des premiers symptômes, permettant de leur éviter des souffrances ultérieures.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition de signes cliniques neurologiques et à décrire l’extension et les caractéristiques des lésions du cerveau, ainsi que les altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.
2. Réduction
Les lots expérimentaux sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d’incubation de la maladie par un test Log-Rank, permettant de mesurer une différence de survie de l’ordre de 20-25%, de la distribution des différents types d’immunomarquages cellulaires et de la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine pathologique. Un lot de 14 souris permet de disposer d’au moins 6 souris, pour les analyses biochimiques et d’au moins 6 souris pour les analyses des lésions du cerveau, prélevés lorsque la maladie apparaît chez la souris. Ces effectifs permettent de déterminer par un test unilatéral si la moyenne des valeurs observées dans une situation est égale ou différente de la moyenne observée dans une autre condition. Les autres prélèvements (yeux, intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire sur les marqueurs périphériques de la maladie dans ce modèle de souris.
3. Raffinement
Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. L’analgésie est prolongée par une injection sous-cutanée de buprenorphine. Les animaux sont maintenus en groupe et dans un environnement enrichi (igloos, nestlets ou sizzles) pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d’abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris, dans lesquelles l’expression de l’alpha-synucléine humaine mutée A53T permet les comparaisons des durées de survie et de la neuropathologie, en particulier suite à l’inoculation d’AMS. Les souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines, permettent l’inoculation des extraits cérébraux dans une région précise du cerveau, et celles-ci qui sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie caractéristique de cette lignée de souris, lors de laquelle elles sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.