Génotypage de poissons zèbres, sans phénotype dommageable, pour l’étude de mécanismes impliqués dans un type de mémoire , l’habituation.

Le projet est une caractérisation génétique de 8 lignées de poissons âgés de 2 mois, génétiquement modifiés. Ces poissons seront ensuite élevés puis croisés entre eux afin d’obtenir des larves âgées de moins de 5 jous, non soumis à l’expérimenation animale, pour les études afin de comprendre comment les animaux apprennent et forment des souvenirs. S’il est clair que les souvenirs se forment grâce à la plasticité des réseaux neuronaux, de nombreuses questions restent ouvertes. Par exemple, dans un circuit neuronal complexe de vertébrés, lesquels et combien de neurones sont soumis à la plasticité ? Quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans cette plasticité ? Pour répondre à cette question des poissons zèbres sont utilisées car leur cerveau est relativement simple (~100 000 neurones), petit (0,25 mm3) et l’activité de tous les neurones peut être mesurée de façon indépendante. Lorsqu’il est stimulé par un flash de lumière ou un bruit, le poisson zèbre réagit par un sursaut. En cas d’éclairs ou de bruits répétés, cette réponse diminue, formant un type de mémoire à long terme connu sous le nom d’habituation. Afin d’étudier cette habituation, nous disposons de 8 lignées de poisson zèbre portant des mutations, non dommageables, sur différentes protéines. Ces poissons seront croisés entre eux pour étudier le comportement de leur descendance, âgèe de moins de 5 jours et donc non soumise à l’expérimentation animale. L’étude du comportement des poissons correspondra à l’étude de leur habituation suite à l’extinction de la lumière.

La caractérisation génétique des lignées pour optimisation de la gestion des élevages est nécessaire car l’étude de l’habituation chez le poisson zèbre âgé de moins de 5 jours, nécessite d’avoir tous les génotypes possibles analysés en simultanée dans la même expérience. Par exemple pour un simple mutation, en croisant deux poisson +/-, nous aurons des larves âgées de moins de 5 jours ayant les généotypes +/+;+/- et -/-. Le fait de garder, après génotypage, les parents sous forme +/- est le seul moyen, le plus rationnel, d’avoir les larves âgées de moins de 5 jours avec les 3 génotypes voulus.

Les poissons agès de 2 mois, seront génotypés par prélèvement d ‘une partie infime de leur nageoire caudale afin de ne garder que les individus hétérozygotes. Le génotypage sera fait par balnéation et anesthésie du poisson à la Tricaine; un bout de la nageoire caudale sera coupée . Le temps total de la procédure sera le plus court possible (moins de 2 min). Les poissons seront placés rapidement dans un bac de réveil rempli d’eau avant d’être transféré dans son aquarium. Cette procédure concerne tous les poissons de cette demande mais seuls le nombre de poissons nécessaires à obtenir les effectifs souhaités subiront le génotypage, les autres ne seront pas génotypés dés lors que les effectifs voulus sont atteints. Les chiffre donnés sont donc des maximums et le prélèvement sera le seul geste invasif faits sur les animaux et une seule fois dans leur vie.

Le génotypage des poissons se fera par découpe d’une extrémité de la nageoire caudale d’une surface inférieure à 0.25 mm2 sous anesthésie dans un délai très court. Les nuisances ou effets indésirables, extrêment rares avec ce protocole établi et utilisé en routine, seront visibles au moment de l’endormissement, du réveil (trop long ou visualisé par une nage inhabituelle), des lésions suite à la biopsie ou de la non repousse, dans des cas exceptionneles, de la nageoire (qui doit être totale au bout de 15 jours). Tout phénotype inhabituel entrainera la mise à mort immédiate du poisson.

Les poissons une fois génotypés seront divisés en deux catégories. Les poissons hétérozygotes seront maintenus en vie pour être mis en croisement afin de faire des expériences d’habituation sur leurs descendants âgès de moins de 5 jours (non sousmis à une demande) et pour être mis en croisement pour obtenir la génération suivante. Les poissons ayant tous les autres génotypes possibles seront mis à mort car nous souhaitons maintenir les lignées sous forme hétérozygote. En effet, ce n’est que par croisement de poissons hétérozygotes entre eux que nosu obtiendrons des larves (non soumis à une dap) ayant tous les génotypes souhaités.

Le poisson zèbre est un animal modèle facile à élever (animal petit, robuste, possédant d’excellentes capacités de reproduction). De plus, 70% des gènes du poisson zèbre ont un équivalent chez l’homme. Enfin, ce génome s’est montré facilement manipulable, ce qui a conduit à la création de milliers de mutants dont ceux utilisés dans ce projet. Les études comportementales associées à des approches d’imagerie sur l’organisme entier, à une résolution pouvant atteindre l’échelle cellulaire (poisson optiquement transparent jusqu’à 4 semaines) fait du poisson zèbre un modèle pertinent. Ces approches d’étude de comportement à haut débit et l’imagerie sur animal entier, ne sont absolument pas applicables en routine sur d’autres modèles vertébrés ce qui fait du poisson zèbre comme modèle vertébré un modèle idéal. Du plus il s’agit d’un modèle dont le cerveau est relativement simple comparativement à d’autres modèles et il est donc plus facile d’obtenir des résultats interprétables Les lignées sont déjà établies. Les génotypages des adultes pour chaque génération se feront au stade 2 mois. A ce stade les poissons sont assez grands pour que le génotypage de la nageoire caudale se fasse sans séquelle, celle-ci étant assez développée