Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 11/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-622777)
828 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses humaines dans les canaux mammaires ou sous la peau, des séances d’imagerie sous anesthésie et, pour certaines, une ablation des ovaires et des traitements hormonaux, sur une durée pouvant atteindre un an. Le porteur affirme que les tumeurs resteront le plus souvent petites et peu douloureuses, les animaux étant tués pour récolter ces tumeurs. Il indique recourir à des cultures en trois dimensions mais juge la vérification in vivo obligatoire, la réponse de ces cultures aux hormones étant « contestée ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Établir des lignées cellulaires de cancer du sein à partir de tumeurs de patientes. Créer des lignées cellulaires de cancer du sein à partir de tissu mammaire normal. Caractériser l’effet d’oncogènes sur la différenciation de lignées de cancer du sein. Tester la réponse de ces lignées aux traitements pour le cancer du sein. Abréviations: PDX: xénogreffe dérivée de tumeur de patiente (« Patient Derived Xenograft »). GDX: xénogreffe dérivée de cellules normales converties en cellules tumorales (« Genetically Defined Xenograft »). SARM: androgène sans effet virilisant (« Selective Androgen Receptor Modulator »).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les lignées créées permettront de comprendre la réponse aux traitements hormonaux du cancer du sein. Nous avons montré qui les androgènes sans effet virilisant, dites SARMs, inhibent la croissance des tumeurs résistantes aux traitements avec les anti-estrogènes habituels. Les SARMs ont le double avantage d’être très bien acceptés par les femmes, contrairement aux traitements classiques qui sont abandonnés par la moitié des femmes. Le problème est que nous ne comprenons pas pourquoi certaines tumeurs du sein sont inhibées et d’autres sont stimulées par les androgènes. Le bénéfice attendu donc est de pouvoir mieux choisir quelles patientes devraient recevoir les SARMs. Jusqu’à présent il était presqu’impossible d’établir des lignées cellulaires de tumeurs du sein hormonosensibles. Nous avons montré que la culture 3D, dite organoïde, combinée avec l’injection intracanalaire permet de créer des lignées hormonosensibles à partir de tumeurs de patientes, et nous avons montré que la même approche permet de créer des tumeurs hormonosensibles à partir de cellules mammaires normales en ajoutant des oncogènes mammaires. Ces derniers permettent de disséquer les mécanismes de régulation de la croissance par les stéroïdes parce que on peut modifier les gènes qu’on utilise pour créer les tumeurs. Un deuxième avantage de l’injection intracanalaire est que ça met les cellules au site d’origine des tumeurs du sein. Elle permet donc de suivre la progression des tumeurs dès la première étape de formation de la tumeur.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Nous injecterons des cellules tumorales dans les mamelons ou sous la peau. La procédure durera environ 10 min par animal. Si nous injectons les cellules dans le mamelon, une crème analgésique sera mise sur la peau autour du mamelon pour prévenir la douleur immédiatement après l’injection. Les cellules tumorales émettront une lumière dite bioluminescence qui permettra de quantifier la croissance de la tumeur. Les souris seront anesthésiées pour scanner la bioluminescence. La durée d’un scan sera d’environ 15 min. Les souris seront scannées une semaine après l’injection des cellules, puis une fois par mois pour suivre la croissance des tumeurs si nous voulons simplement établir une lignée tumorale. Dans ce cas l’expérience pourrait durer 1 an si la tumeur poussait très lentement. Si les cellules tumorales ont besoin de l’estrogène pour survivre, la souris pourrait recevoir de l’estrogène dans le biberon pendant tout ce temps. Pour évaluer la réponse aux traitements les souris seront scannées tous les 7-14 jours. Si un traitement antitumorale est mis dans le biberon, la durée sera
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Dans la majorité des cas les tumeurs seront tellement petites qu’elles ne seront détectables que par bioluminescence, ou par des analyses au laboratoire après la mort de l’animal (microscopie fluorescente et histologie). L’impact sur le bien-être des souris sera limité essentiellement aux procédures et donc aux injections et à la chirurgie pour enlever les ovaires. Les injections dans les canaux galactophores seront faites avec une aiguille tellement fine que la blessure sera à peine visible à l’oeil nu. Pour éviter la douleur après la chirurgie pour enlever les ovaires les souris recevront un traitement analgésique (la buprénorphine) 20 minutes avant l’intervention et pendant les jours suivant l’intervention si nécessaire. Même quand les tumeurs seront palpables, elles auront peu d’effet sur le bien-être des animaux (les tumeurs équivalentes chez les femmes ne sont pas douloureuses). Les tumeurs ne feront presque jamais d’ulcères cutanées. Les traitements prévus sont des traitements hormonaux (androgènes, anti-androgènes, estrogènes, anti-estrogènes et produits similaires). Comparés à la chimiothérapie il s’agit de traitements doux qui ont certes des effets physiologiques, par exemple sur la croissance des canaux galactophores, mais n’induisent pas les effets secondaires qu’on craint avec la chimio (diarrhées, anémies, pertes de poids). Les pellets d’estrogène peuvent provoquer la rétention urinaire s’ils sont utilisés pendant plus de 3 mois donc nous limiterons la durée du traitement à 3 mois dans ces cas. L’estrogène dans les biberons n’a pas cet effet donc les biberons seront utilisés s’il faut donner de l’estrogène pendant des périodes prolongées.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Mise à mort pour récolter les tumeurs.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Plusieurs nouvelles approches de cultures cellulaires dites « organoïdes » viennent d’être inventées. Les milieux utilisés pour la culture organoïde maintiennent le caractère des cellules tumorales mieux que les milieux de culture classique. Au lieu de pousser sur une boîte en plastique, les cellules flottent dans un gel où elles forment des petits amas sans toucher le plastique. A l’échelle d’une cellule, le plastique est plus rigide que l’os, ce qui change complètement le comportement des cellules. Pour les tumeurs du sein l’avantage de la culture organoïde est que les cellules tumorales continuent à produire les protéines pour détecter les stéroïdes. On s’attend donc à ce que les réponses aux médicaments en culture organoïde prédisent mieux les réponses dans les patientes. Autant que possible nous utilisons ces approches pour tester l’efficacité des médicaments mais la réponse des organoïdes aux stéroïdes est actuellement contestée et nous sommes obligés de vérifier au moins les résultats importants in vivo. Par ailleurs, les cultures organoïdes sont rarement pérennes et il faut donc maintenir un stock des cellules dans les souris pour éviter de les perdre.
2. Réduction
L’injection dans les canaux galactophores est beaucoup plus efficace que l’injection sous la peau pour les tumeurs du sein hormonosensibles. Nous avons donc besoin de moins d’animaux pour obtenir le même nombre de tumeurs. Nous avons déterminé via des tests statistiques (test t de Student avec une puissance de 80% et une valeur p de 0.05) qu’un lot de 10 souris par groupe était nécessaire pour avoir des données statistiquement exploitables à la fin de l’étude.
3. Raffinement
Afin d’être moins invasif, nous marquerons les cellules tumorales avec des protéines qui émettent la lumière. Ceci permettra de suivre la croissance des tumeurs quand leur taille sera nettement inférieure aux tailles habituelles. Par conséquent il sera souvent possible d’arrêter l’expérience avant que les tumeurs ne soient palpables ou visibles à l’oeil nu. Afin d’éviter la douleur, les souris seront anesthésiées pendant les interventions potentiellement douloureuses. Afin de protéger les animaux contre les infections, nous utiliserons des cages stériles. Plus globalement en matière de raffinement, le bien-être des animaux sera pris en compte dès leur naissance jusqu’à leur mort. Pour réduire la souffrance et l’angoisse, les animaux seront hébergés collectivement, cinq souris par cage, avec accès en permanence à l’eau et à la nourriture. Chaque cage sera pourvue d’un enrichissement du milieu (nids de « woodwool »). Les souris seront manipulées par du personnel formé et qualifié. L’estimation de la souffrance sera réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés seront basés directement sur les conseils des autorités françaises et européennes.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Il faut utiliser des animaux immunodéficients pour éviter le rejet des cellules humaines. De nombreuses études ont montré que les souris immunodéficientes dites « NSG » permettent de greffer les cellules humaines. Les canaux galactophores de souris maintiennent le caractère hormonosensible des tumeurs du sein humaines. Souris adultes (il n’y a pas assez de canaux galactophores pour faire les injections avant 6 semaines).