Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2022-02-08 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-640812)
552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur décrit des injections intraveineuses de vecteurs viraux dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, suivies de prélèvements sanguins au même endroit sous anesthésie locale, puis d’une mise à mort par dislocation cervicale. Il indique surveiller l’apparition de fièvre et de lésions oculaires, un œil infecté ou dégradé entraînant la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme qu’aucune méthode alternative n’apporte le même niveau d’information sur l’expression des molécules in vivo.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Nous nous intéressons au développement de molécules agissant sur le système immunitaire exprimées par des vecteurs viraux notamment pour traiter l’immunosuppression post-sepsis. De nombreuses molécules existent sous forme de protéines recombinantes dont certaines d’entre elles sont déjà en développement clinique dans le traitement de l’immunosuppression post-sepsis. L’expression d’une ou plusieurs de ces molécules via un vecteur viral pourrait permettre une expression prolongée, une distribution différente dans l’organisme, voire engendrer une activité biologique différente de celle de la forme soluble et ainsi avoir une efficacité accrue. Des études précédentes ont permis d’obtenir une preuve de concept pour un candidat basé sur un vecteur viral codant pour une molecule agissant sur l’immunité adaptative, administré par voie intraveineuse. Dans le but d’optimiser ce 1er candidat, nous voulons évaluer dans une étude préclinique exploratoire, la possibilité de co-exprimer dans ce vecteur, une molécule agissant sur l’immunité innée avec la molécule agissant sur l’immunité adaptative déjà validée, chez la souris naïve puis dans un modèle murin de souris spécifique de l’immunosuppression induite par le sepsis. Agir à la fois sur la réponse immunitaire innée et adaptative pourrait permettre une meilleure restauration du système immunitaire et ainsi diminuer le temps d’hospitalisation, le taux d’infection secondaire et in fine le taux de mortalité post-première infection et/ou seconde infection. Plusieurs candidats ont été développés : un pour chacune des molécules seules et un pour les deux ensembles. L’objectif final est de démonter l’intérêt de co-exprimer deux molécules agissant sur les deux pans du système immunitaire pour traiter l’immunosuppression induite par le sepsis, dans un même vecteur. Cependant, le modèle murin de sepsis utilisé étant classé sévère, il est primordial de vérifier l’efficacité des produits dans des souris naïves au préalable. En effet, si le(s) produit(s) n’avai(en)t pas l’effet escompté sur le système immunitaire, ou que l’ajout de la seconde cytokine s’avérait délétère pour l’activité déjà connue du produit, il ne serait alors pas testé dans le modèle sepsis.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements pour traiter l’immunosuppression induite par le sepsis en restaurant le système immunitaire (réponse innée et réponse adaptative) des patients septiques et ainsi prévenir les infections secondaires pouvant leur être fatales. L’objectif à court terme de ce projet de recherche est de monter la pertinence de vectoriser deux molécules dans un même vecteur en prouvant que la molécule agissant sur la réponse immunitaire innée et la molécule ciblant la réponse immunitaire adaptative sont capables de booster le système immunitaire de souris saines. En cas d’obtention de ce résultat, ce candidat sera alors évalué dans le modèle qui mime les deux phases clées du sepsis. Si ce candidat permet de restaurer l’immunosuppression induite chez la souris, il pourrait faire l’objet d’un développement clinique afin d’espérer obtenir une autorisation de mise sur le marché afin de soigner l’immunosuppression chez l’homme dans l’indication du sepsis.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
1) Préhensions des animaux vigiles (transfert de la cage hébergement à la boite d’anesthésie puis de la boite d’anesthésie sur le plateau de la hotte) : 3 fois/souris (540 animaux et 15 secondes /souris) -2) Injections des produits en intraveineuse au niveau du sinus rétro orbitale sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane sur tous les animaux : 540 Souris (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) -3) Application de l’anesthésique en locale : 1 contention pour 432 souris et 2 contentions pour 108 souris (15 secondes/souris/contention) -4) Prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitale sur animaux vigiles en contention sous anesthésie locale. 456 souris seront prélevées une fois avec 1 contention (1 à 2 min/souris) 96 animaux seront prélevés deux fois soit deux contentions (2 fois 1 à 2min/souris/contension). -5) Contention de l’animal vigile puis mise à mort des animaux par dislocation cervicale 540 animaux et 30 secondes/souris
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nos candidats ne devraient pas avoir d’effet delétère sur l’état géneral des animaux. Néanmoins, les animaux seront observés 2 fois après injection des candidats (à 2h et 6h post injection). Si les souris sont prostrées dans la cage et ne réagissent pas à une stimulation, une prise de température sera effectuée. Si une fièvre supérieure à 39°C pendant deux jours malgré un traitement au doliprane persiste pouvant traduire une souffrance, les souris seraient alors mises à mort. les animaux subiront en plus de l’injection du candidat des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétroorbital après anesthésie locale à la tétracaïne.Les animaux subiront en plus de l’injection du candidat des prélèvements sanguins après anesthésie locale. Les yeux seront donc surveillés tout le long de la procédure, en cas d’apparition de lésion, les yeux seront nettoyés au serum physiologique afin de mieux évaluer les dommages. Si à l’observation, une infection bactérienne ou/et une dégradation de l’œil sont observées, l’animal sera mis à mort.Les animaux subiront en plus de l’injection du candidat des prélèvements sanguins après anesthésie locale. Les yeux seront donc surveillés tout le long de la procédure, en cas d’apparition de lésion, les yeux seront nettoyés au serum physiologique afin de mieux évaluer les dommages. Si à l’observation, une infection bactérienne ou/et une dégradation de l’œil sont observées, l’animal sera mis à mort.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux inclus dans les procédures sont mis à mort puis le sang et/ou organes sont prélevés nous permettant d’évaluer l’efficacité de notre produit d’immunothérapie. Aucune souris restante à la fin des deux procédures.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la durée et le taux d’expression des molécules 1 et 2 seules ou co-exprimées par les candidats in vivo et de mesurer les activités immunologiques sur différents types cellulaire provenant de différents organes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants et susceptible d’apporter le même niveau d’information pour répondre à ces objectifs.
2. Réduction
Tout au long du projet, nous essayerons de réduire le nombre de souris sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Le sang de 3 souris/groupe/temps sera prélevé pour suivre le taux des differentes molécules (nombre d’animaux suffisant, basé sur les résultats des procédures précédemment réalisées dans le cadre du projet global), pour limiter le nombre d’animaux. Six souris/groupe sont prévues pour couvrir l’éventuelle variabilité des tests immunologiques (variabilité plus importante pour ces tests immunologiques déjà observée au préalable) et permettre l’analyse statistique (tests non-paramétriques). Ce type d’expérience ayant déjà été réalisé au cours du projet global, le nombre d’animaux proposé ici pour chacun des types de tests est le minimum requis pour obtenir un résultat fiable. Dans la procédure 1, l’activité biologique sera évaluée à différents temps afin de pouvoir déterminer le(s) temps d’analyse permettant de voir l’effet biologique optimal de notre candidat. Grâce à cette procédure, nous réduirons le nombre de temps d’analyse pour la suite du projet et donc le nombre de souris utilisées. Si toutefois, le nouveau candidat ne donnait pas les résultats escomptés, le projet serait arrêté (pas de procédure 2). Dans ce projet, pour chaque procédure nous prélèverons post morterm la plupart des organes cibles de notre candidat afin de répondre à un maximum de question dans un seul protocole.
3. Raffinement
Mise en place du raffinement dans nos procédure : L’injection intraveineuse de nos candidats est réalisée sur animaux sous anesthésie générale gazeuse. Les prélèvements sanguins à l’œil se font sur animaux après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. Tout au long des procédures nos animaux sont surveillés au moins 5 fois par semaine avec une observation accrue après injection de nos candidats (2h et 6h post injection) même s’il n’est pas attendu d’effet délétère de nos produits sur l’état général des animaux. Néanmoins, en cas d’apparition de signes cliniques (pelage ébouriffé, terne), une surveillance accrue avec suivi de la température sera effectuée. En cas de fièvre (température > 39°C), du doliprane sera donné dans l’eau de boisson. Si persistance de la fièvre (> 2 jours) ou de tout autre signe clinique (immobilité, prostration, apathie) pouvant traduire une douleur/détérioration de l’état général, ce sera un critère de point limite et il y aura mise à mort de l’animal.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est un bon modèle animal pour étudier la réponse immunitaire car le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. De plus ces études précliniques nécessitent un grand nombre d’animaux, il ne serait donc pas envisageable de les réaliser dans le modèle de primate non humain pour des raisons éthiques. D’autre part, ayant déjà validé l’efficacité d’un des candidats dans ce modèle murin, il nous semble pertinent de valider le candidat exprimant la molmécule-1 et le candidat coexprimant les 2 molécules dans le même modèle. Ces produits d’immunothérapies sont développés pour être utilisés chez l’homme et ils devraient cibler des patients adultes. Pour rester au plus proche de ce qui sera fait chez l’homme, nous utiliserons des souris d’au moins sept semaines (ayant un système immunitaire suffisamment mature) pour ces études précliniques.