Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-02-16 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-647909)
Toutes tuées pour analyses post-mortem, 2039 souris, dont 1845 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, sont utilisées pour reproduire des tumeurs rhabdoïdes, des cancers pédiatriques. Elles subissent des greffes de fragments tumoraux sous la peau ou des injections de cellules dans le cerveau, y compris chez des souriceaux de sept jours, suivies de traitements par gavage et de séances d’imagerie sous anesthésie. Selon le porteur, la localisation cérébrale des tumeurs peut provoquer des troubles moteurs, des difficultés à s’alimenter et une perte de poids. Il annonce des traitements pour les enfants « à relativement court terme », tout en développant en parallèle des organoïdes humains censés réduire le recours aux souris.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les tumeurs rhabdoïdes sont des cancers très agressifs touchant des jeunes enfants et dont l’origine cellulaire est mal connue. Leur localisation est variée (système nerveux central, tissus mous, reins…) mais elles présentent des caractéristiques cliniques et histologiques communes. A ce jour, trois sous-types de tumeurs rhabdoïdes cérébrales ont été décrits (« MYC », « SHH », « TYR »), probablement en lien avec leurs diverses cellules d’origine. Aucune thérapie standard n’est établie à ce jour, les chimiothérapies fortes et l’irradiation étant peu efficaces et lourdes pour de très jeunes enfants. Il est donc nécessaire de trouver des traitements nouveaux, testés au laboratoire avant d’être donnés aux enfants. Les tests de médicaments sur des lignées cellulaires in vitro sont la première approche du projet. Ensuite, il est nécessaire de vérifier que les molécules candidates ont une efficacité sur des organismes vivants. Pour cela, nous avons développé des modèles dans lesquels des tumeurs murines issues de modèles transgéniques (mis au point il y a plusieurs années) ou issues de patients ont été greffées sur des souris et nous souhaitons traiter les souris greffées avec les molécules candidates afin de retenir celles qui méritent un développement clinique. En parallèle de ces travaux, nous développons des modèles de souris génétiquement modifiées, permettant d’obtenir de façon très sélective des tumeurs précoces, en particulier cérébrales, très similaires aux tumeurs observées chez les enfants. Nous projetons d’isoler des cellules du cerveau des souris à un stade précédant la transformation cancéreuse en les isolant de cerveaux prélevés chez les embryons de souris génétiquement modifiées afin de tenter de les maintenir en culture in vitro, et ex vivo, dans des organoïdes de cerveaux. Par la suite afin de démontrer leur pouvoir oncogénique in vivo, nous injecterons ces cellules dans le cerveau de souris d’âges divers, tenant compte du fait que la maturation du cerveau environnant peut jouer un rôle pour ces cancers cérébraux très précoces : à 7 jours de vie, à la fin du premier mois, à l’âge adulte. Nous savons donc dorénavant cibler avec plus de précision les cellules dans lesquelles les tumeurs prennent naissance et souhaitons approfondir notre compréhension moléculaire des différents sous-types de tumeurs rhabdoïdes obtenues.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Gains attendus des modèles de greffes de cellules et tumeurs, et des tests réalisés sur ces greffes Le projet permettra d’une part une meilleure compréhension théorique des tumeurs rhabdoides en particulier les étapes de transformation de la cellule d’origine vers la cellule tumorale et d’autre part, de développer des modèles précliniques afin d’évaluer des thérapies. Le développement de modèles de tumeurs orthotopique chez la souris (injection intra-cerebrale comme chez les patients) permettra d’évaluer des traitements expérimentaux en tenant compte de la localisation dans le cerveau comme les 2/3 des tumeurs rhabdoides chez les patients. Ces modèles d’étude ont pour objectif d’aboutir à des traitements contre certaines tumeurs pédiatriques pour les enfants avec la meilleure chance possible d’efficacité, à relativement court terme.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Dans une première et deuxième procédure, visant à établir les modèles précliniques pour évaluer les thérapies, les animaux sont greffés soit avec des fragments de tumeurs par voie sous cutanée soit avec des cellules tumorales par voie intracérébrale, sous anesthésie (1x par expérience sur une durée d’environ 30 min). Les animaux vigiles sont ensuite traités avec diffèrents médicaments par injection intrapéritonéale ou gavage (3 fois par semaine, pendant 4 semaines – durée du geste inf à 20sec), Dans une troisième procédure permettant de générer des tumeurs intracérébrales à suivre par imagerie, les souris (de 3 âges différents) seront injectées avec des cellules tumorales en intracérébral. Cette chirurgie s’effectue en 30 min sous anesthésie générale. Puis la croissance tumorale sera suivie par imagerie sous anesthésie générale 1 à 2 fois par semaine au long de l’expérience (durée de l’imagerie : 10min). Dans une quatrième procédure visant à générer des tumeurs murines spontanées au niveau cérébral, . Les croisements entres souches appropriées sont réalisés et les souris ne subissent aucun geste technique de leur vivant. Dans une 5ème procédure utilisant des modèles de tumeurs spontanées, certains animaux vigiles recevront un produit par gavage, 1 seule fois au cours de la procédure. Les autres ne subissent aucun geste technique de leur vivant.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les greffes en sous-cutané peuvent induire des douleurs après incision cutanée et suture par agrafes pendant maximum 48h.Le développement des tumeurs en sous-cutané peut occasionnellement gêner la mobilité des animaux. Les greffes intra-cérébrales peuvent induire des douleurs dans les 48h suivant la procédure de chirurgie invasive et la possibilité de complication (infectieuse) de la plaie (évènement rare). Selon la localisation de la tumeur au niveau cérébral,des troubles de la motricité avec des difficultés à s’alimenter et donc une perte de poids peuvent apparaitre. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements (produits non douloureux) seront celles liées à l’injection intrapéritonéale ou au gavage (gène de courte durée).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Au préalable à chaque étude préclinique chez la souris testant l’efficacité d’un traitement, nous réalisons des tests in vitro sur des lignées cellulaires issues des tumeurs rhabdoides nous permettant de sélectionner les molecules avec les effets les plus prometteurs pour passer ensuite chez l’animal. Il est nécessaire d’utiliser le modèle animal afin de reconstituer toutes les interactions entre tous les types cellulaires.Néanmoins, pour limiter l’utilisation des souris, nous développons également en parallèle des tumoroïdes ainsi que des organoïdes humains à partir de cellules souches. Ce qui permettrait de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales pour ensuite les évaluer sur les souris. Les modèles murins restent les modèles les plus performants pour identifier les cellules d’origine des tumeurs et permettre une description des étapes précoces de la transformation cancéreuse. A ces égards, ils ne restent qu’imparfaitement remplaçables par des modèles ex vivo.
2. Réduction
1.Greffes et tests sur ces greffes Avant chaque étude thérapeutique préclinique, des tests in vitro nous permettent de sélectionner les molécules à tester sur des lignées cellulaires de tumeurs rhabdoïdes. Nous limitons les expériences in vivo à celles pour lesquelles un rationnel in vitro est établi. – Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum pour des expériences de test d’efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Nous limiterons le nombre de souris greffées pour chaque modèle tumoral, mais en maximisant le nombre de modèles greffés afin de reproduire la diversité observée en essais cliniques chez l’homme. Chaque tumeur sera coupée en plusieurs échantillons afin de réaliser plusieurs analyses post-mortem sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cela permet également un suivi transversal des tumeurs et améliore la significativité des expériences. 2. Etudes de cellules neuronales génétiquement modifiées -Nous limiterons à 3 le nombre maximal de tumeurs obtenues après greffes de cellules issues de cerveaux de nos souris génétiquement modifiées. La procédure d’établissement des tumeurs ne sera pas poursuivie au-delà. – les cellules tumorales exprimeront des marqueurs bioluminescents pour être suivies au cours du temps par une caméra externe à la souris, permettant un suivi de la croissance tumorale en temps réel chez l’animal vivant, afin de limiter le nombre de mises à mort « à l’aveugle ». 3.Modèles transgéniques Pour les nouveaux modèles, le phénotype d’au moins 10 souris ayant le génotype d’intérêt devra être décrit. Si les premiers phénotypes sont très identiques, le nombre de souris étudiées ne dépassera pas 10. La caractérisation des tumeurs attendues dans ces génotypes nécessitera des analyses en histologie et biologie moléculaire ; chaque tumeur sera répartie en plusieurs morceaux pour permettre le plus grand nombre possible d’analyses par échantillon. Après description du phénotype, les lignées seront maintenues avec un génotype n’exposant pas à un phénotype dommageable
3. Raffinement
1.Greffes Dès que cela n’implique pas de stress ou de l’angoisse supplémentaire, une méthode d’anesthésie par voie gazeuse sera utilisée pour réaliser les gestes techniques nécessaires à l’expérimentation. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux ou généraux pendant l’opération et si besoin post-opératoire. Un gel oculaire serait utilisé pour prévenir le dessèchement de la cornée si l’anesthésie devait durer plus de 5 min. Le réveil de l’animal se fera sur tapis chauffant et sera surveillé par l’expérimentateur. Les animaux seront observés tous les jours jusqu’à ce qu’ils récupèrent de l’intervention, et leur état sera évalué selon la grille de score du SBEA. Pour les greffes sous-cutanées, la croissance tumorale sera mesurée à l’aide d’un pied à coulisse Les souris seront euthanasiées dès que des signes de dégradation clinique seront observés, tels que décrits dans la grille de score Pour les greffes intra-cérébrales : l’injection de cellules dans le cerveau exprimant une fluorescence que l’on peut quantifier par caméra externe à l’animal (marqueur bioluminescent) permettra de suivre la croissance tumorale par une méthode non invasive. Cette quantification par imagerie sera réalisée de 1 à 3 fois par semaine et sous anesthésie gazeuse. 2. Modèles transgéniques Afin d’aider les souris qui souffriraient de troubles de la mobilité empêchant d’accéder à la nourriture, nous veillerons à disposer dans les cages de l’aliment gélifié. L’animal peut être isolé si nécessaire afin d’éviter de mauvaises interactions avec d’autres animaux. Les animaux seront suivis grâce à la grille des scores définissant les points limites et donc la fin de l’expérience.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté physiologique avec l’Homme. Ce modèle est utilisé dans de nombreuses études en cancérologie, notamment pour des expériences de greffes en sous-cutanée et orthotopiques afin de mettre au point des traitements dans les conditions d’un organisme vivant. Par ailleurs, les modèles murins génétiquement modifiés que nous prévoyons d’étudier sont pour certains déjà développés et bien caractérisés : nous savons qu’ils sont très adaptés mais qu’ils ne recouvrent pas toute la diversité moléculaire de la maladie humaine. Les modèles génétiquement modifiés à développer devraient offrir, selon nos hypothèses, un niveau de pertinence plus complet pour l’étude des divers sous-types de la maladie humaine, en ciblant des progéniteurs plus restreints. Les souris immunodéficientes et normales arriveront à l’animalerie âgées de 5 semaines. Après une période d’adaptation d’une semaine minimum à l’animalerie, les animaux seront alors utilisés à l’âge de 7 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats. Les animaux issus des lignées génétiquement modifiées seront observés de leur naissance jusqu’à l’âge adulte. Afin d’étudier à quels stades du développement embryonnaire les cellules commencent le processus de transformation cancéreuse, nous sacrifierons des femelles gestantes (pas de phénotype dommageable) et prélèverons les embryons à divers moments de la gestation (entre le 10eme et le 18eme jour post-fécondation) .