Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/04/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-649214)
1 298 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie pour prélever leur moelle osseuse. Trois injections sous-cutanées hebdomadaires d’un médicament dont un effet secondaire connu est la fibrose médullaire, ou une injection unique d’un anticancéreux qui détruit la moelle, servent à abîmer le tissu avant l’expérience proprement dite : une injection rétro-orbitale de colorant ou de cellules à greffer, sous anesthésie maintenue jusqu’à la mise à mort, quarante-cinq minutes plus tard au maximum. La question posée porte sur la perméabilité des vaisseaux de la moelle osseuse, avec l’espoir à terme de mieux réussir les greffes ou de freiner les métastases osseuses. Le porteur écrit que ces expériences sur animal vivant sont « irremplaçables », faute de modèle in vitro reproduisant la complexité de la moelle.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Nous nous intéressons à la barrière sang-moelle osseuse formée par les microvaisseaux de la moelle osseuse, le site unique d’entrée dans la circulation de toutes les cellules sanguines et le site d’entrée des cellules souches lors de greffes de moelle osseuse. Il n’existe à l’heure actuelle aucun médicament pour contrôler la perméabilité et les mécanismes de sa régulation n’ont pas été étudiés. Il est particulièrement important d’entreprendre ces études car différentes pathologies sont susceptibles de modifier la fonction de barrière des vaisseaux sinusoïdes. C’est le cas lors de cancers de la moelle osseuse, et également généralement lors des traitements chimiothérapeutiques des cancers solides. Les objectifs globaux du projet sont de comprendre comment est régulée la perméabilité de cette barrière vis-à-vis des molécules et des cellules. Nous étudierons cet aspect chez la souris saine et après avoir induit des modifications du tissu médullaire à l’aide de traitements actuellement utilisés chez l’homme. La perméabilité aux molécules sera évaluée par la mise en place de modèles d’injection de colorant puis observation après mise à mort des souris et analyse des tissus. La perméabilité aux cellules sera évaluée après greffe de cellules souches (prise de greffe). Nous avons déjà objectivé des acteurs potentiellement importants et pour les étudier nous disposons de souris génétiquement modifiées pour ces protéines et chercherons à évaluer la perméabilité de leurs vaisseaux sinusoïdes, en comparaison avec les souris contrôles appropriées.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les bénéfices à terme visent d’une part les patients développant une fibrose de la moelle ou traités par chimiothérapie, avec la possibilité, une fois la connaissance acquise sur les mécanismes, de pouvoir favoriser ou freiner le passage des cellules sanguines à travers la barrière. Un autre bénéfice important vise cette fois l’entrée de cellules dans la moelle. En comprenant le comportement de cette barrière, on pourra envisager de la moduler pour par ex. accélérer/améliorer la prise de greffe de moelle, ou à l’inverse freiner l’entrée de cellules tumorales pour diminuer les métastases osseuses.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à des injections de substances induisant des modifications du tissu médullaire. La fibrose est induite par injection sous-cutanée (SC) (durée 3 secondes), 1 fois par semaine, pendant 3 semaines (3 interventions), d’un médicament autorisé pour relever la numération plaquettaire chez des patients thrombopéniques et qui a pour effet secondaire d’entrainer des myélofibroses. La chimiothérapie est mimée par injection unique (une intervention) en intra-péritonéale (IP) (durée 3 secondes) sur souris vigile, d’un médicament utilisé dans le traitement des cancers et ayant pour effet secondaire d’entrainer une myélosuppression transitoire. Puis les souris seront soumises à une intervention unique consistant en une anesthésie générale (injection unique d’anesthésiant, 3 secondes). Ensuite, une seule injection, soit de colorant, soit de cellules à greffer, sera effectuée sur les souris toujours sous anesthésie générale, en RO (durée 3 secondes) et l’anesthésie est prolongée jusqu’à la mise à mort des souris (au maximum 45 minutes après l’injection des colorants ou cellules).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
D’après notre expérience, les traitements sont susceptible d’entrainer une modification modérée et transitoire de la numération sanguine. Les souris sont susceptibles d’être stressées du fait de l’induction de l’anesthésie générale ou de la contention. L’injection IP entrainera une probable douleur passagère au point d’injection.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue des procédures, les animaux sont mis à mort pour prélever les tissus d’intérêt et pouvoir analyser la capacité de perméabilité vasculaire des vaisseaux, selon les conditions
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La moelle est l’un des tissus les plus complexe de l’organisme de par la grande diversité de cellules qui le compose, du réseau microvasculaire extrêmement dense, ainsi que toutes les interrelations biochimiques entre cellules dont nous ne connaissons encore pas grand chose. De ce fait, des expériences sur animal vivant sont irremplaçables car il n’existe pas actuellement de modèles in vitro mimant cette complexité. En outre, nous utilisons des modèles de souris inactivées pour des protéines ou mimant une mutation humaine.
2. Réduction
Les méthodes pour visualiser la perméabilité vasculaire sont bien décrites dans la littérature et nous nous y réfèrerons concernant les doses à injecter. Néanmoins, pour l’un des colorant qui n’a pas été testé dans la moelle, nous prévoyons des études pilotes pour définir les doses à utiliser et ainsi éviter de multiplier les expériences pour pouvoir réduire au final le nombre d’animaux. Pour toutes nos expériences, nous avons utilisé des tests statistiques adaptés pour déterminer un nombre d’animaux qui nous permettra d’atteindre l’objectif de votre projet. Lorsque c’est possible, une série de traitement sera utilisée pour différents types d’analyses, afin de réduire le nombre d’animaux.
3. Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués : – Par l’hébergement en groupes sociaux. Les cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui permet aux souris d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 3 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. – Par l’habituation à la contention pour les procédure qui sont répétées, et la distribution de nourriture en gel apétente après chaque geste comme récompense.- Par une anesthésie générale de l’animal avant l’injection des colorants ou cellules, et l’application de collyre avant injection rétro-orbitale, lorsque la souris est anesthésiée, et maintien de l’anesthésie après injection durant le temps de circulation du colorant ou des cellules greffées, au maximum 45 min. – Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les anesthésies, et l’application de gel hydratant sur les yeux. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites, s’ils sont atteints, permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous avons choisi la souris car nous disposont de souris génétiquement modifiées avec inactivations de gènes ou reproduisant des mutations humaines. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, entre 8 et 18 semaines, ceci afin d’éviter des modifications de la moelle liées au vieillissement qui pourraient augmenter les variabilités. Mâles et femelles seront évalués.