Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 07/11/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-653721)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie de Huntington est une maladie génétique incurable causée par une mutation dominante, si un parent porte une version de la mutation il sera atteint et la transmission à sa descendance sera de 50 pour cent. Cette mutation entraîne le dysfonctionnement et la dégénérescence de sous-populations neuronales. Plus spécifiquement, plusieurs étapes du développement cortical sont modifiées. Cependant, les mécanismes physiopathologiques développementaux observés dans la maladie de Huntington, restent méconnus. En particulier, comment des modifications précoces auront des conséquences sur la dégénérescence du cerveau. Dans ce projet, nous évaluerons les conséquences de cette maladie sur la génération des différents types cellulaires du cortex en développement et du cortex adulte, ainsi que les stratégies de compensations qui pourraient se mettre en place pour pallier aux effets délétères de la mutation. Cette étude permettra la découverte de marqueurs permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades très précoces et d’identifier des cibles thérapeutiques pour retarder ou atténuer cette maladie neurodégénérative. MODIFICATION : L’étude de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans le modèle de la maladie implique une modification du projet initial pour injection de traceur sans ajout d’animaux.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’étude des mécanismes sous tendant le développement de la maladie de Huntington permettront à long terme de mettre en évidence des biomarqueurs qui représentent les différents stades d’évolution de la maladie. Après identification de ces différents stades, l’objectif sera de développer des cibles thérapeutiques adaptées afin de retarder ou limiter les symptômes associés à cette pathologie.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 12 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué, rapidement et une seule fois sur chaque animal vigile (moins d’une minute par animal). Nous réaliserons des injections de produits pharmacologiques ou de vecteurs viraux, dans des zones spécifiques du cerveau des embryons en intra utérin. Ces injections nécessitent une chirurgie sous anesthésie générale des femelles gestantes (30-45 minutes, 1 fois). Chaque embryon reçoit une injection intracérébrale. Les animaux impliqués dans les analyses comportementales réaliseront 2 séries (l’une à 3 mois, la deuxième à 6 mois) de 5 tests comportementaux vigiles sur une période d’un mois. Lors du test de privation de nourriture les animaux seront mis à jeun sur une période de 24 heures. Le prélèvement du liquide céphalorachidien implique une chirurgie sous anesthésie générale, une seule fois pour chaque animal pendant 5 minutes maximum. Pour étudier la perméabilité de la barrière entre le système nerveux et le système sanguin une partie des animaux recevra une injection d’une molécule fluorescente (une seule fois, vigile, durée inférieure à 1 minute) puis seront euthanasiés au maximum 2 heures après. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire appropriée, efficace et reproductible.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le prélèvement pour génotypage est réalisé sur animaux vigiles. Cet acte peut générer une légère douleur chez l’animal. L’acte d’injection pratiqué sous anesthésie peut générer de la douleur lors de la chirurgie et en post opératoire pendant quelques jours. Il y a un risque lors de l’anesthésie (dépression cardiorespiratoire, hypothermie), ainsi qu’un risque infectieux et hémorragique. Le prélèvement de liquide céphalorachidien réalisé sous anesthésie sera suivi d’une euthanasie, il n’y aura donc pas de douleurs post-opératoires associées. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. Le test de suppression de nourriture peut également induire un état de stress et de fatigue chez les animaux. Ce test nécessite une privation de nourriture pendant vingt-quatre heures et met en évidence une activité de type antidépressive. L’injection d’une molécule pour évaluer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique sera associée à une légère et brève douleur au point d’injection, qui pourra être suivie d’un inconfort de courte durée. La mutation génétique portée par les animaux des 2 lignées peut générer des souffrances à partir de l’âge de 12 mois (phénotype dommageable) : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem, prélever des embryons, ou parce qu’il ne sera pas possible de les réutiliser ou replacer du fait de leur modification génétique.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude du cerveau en développement nécessite le recours à un modèle animal car il permet de préserver l’environnement du développement utérin (impliquant différents types cellulaires qui interagissent entre eux, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire). L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec un modèle de mammifère qui permet de suivre l’évolution du cerveau tout au long du développement et de la vie de l’animal. Le développement cérébral et la génétique de la souris présentent des similarités avec ceux de l’Homme. Ces éléments font de la souris un modèle indispensable pour notre étude. Nous utiliserons des cultures cellulaires afin de valider les outils moléculaires qui seront ensuite injectés chez l’animal.
2. Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Il a été déterminé en réduisant au plus petit nombre le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables. Pour cela nous utiliserons des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisées. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés. Pour la totalité du projet nous estimons que nous utiliserons au maximum 6150 animaux.
3. Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficient d’eau et de nourriture adaptée à leur stade physiologique à volonté et sont observés quotidiennement. Les animaux seront euthanasiés à 6-8 mois, avant apparition du phénotype dommageable, excepté pour les quelques animaux gardés jusqu’à 12 mois pour certaines procédures, qui seront particulièrement surveillés pour détecter des difficultés locomotrices et une prostration, 2 signes caractéristiques liés à la mutation. Nous réaliserons des accouplements avec des souris non génétiquement modifiées afin d’éviter toute dérive génétique. La biopsie de queue pour le génotypage sera réalisée sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide) et limitée au strict minimum. Le geste est rapide, parfaitement maitrisé, et réalisé dans un endroit dédié au calme. Une surveillance adaptée du souriceau est mise en place après le geste. Cette technique de prélèvement permet d’obtenir une quantité suffisante d’ADN pour le génotypage sans risque d’induire des effets indésirables majeurs pour l’animal. En effet sur un animal si jeune il ne serait pas possible d’obtenir la quantité de poils suffisante, un prélèvement de sang pourrait induire un choc hypovolémique et la biopsie d’oreille n’est pas possible avant 2 semaines du fait de la petite taille des oreilles. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Afin d’améliorer le bien-être de la mère dans les cages post chirurgie ajout d’une maison, d’un nid en coton et d’une nourriture enrichie (hydrogel, nourriture facile d’accès). Les chirurgies sont réalisées le matin afin d’observer les animaux le soir et administrer les médicaments nécessaires. Une liste d’observation post opératoire sera remplie. Après les chirurgies, les animaux seront observés (infections, mauvaise cicatrisation, prostration ou d’agitation et perte de poids anormaux) 2 fois par jour par l’équipe, et chaque jour par l’animalerie. Une grille de scoring de la douleur sera utilisée. Les nouveaux nés post chirurgie seront suivis durant les premiers stades de vie pour s’assurer que la modification induite par la chirurgie n’entraine pas de modification développementale dommageable. Une grille de score clinique sera utilisée dès la naissance. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris afin qu’elle se fasse sans douleur.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Il n’existe pas d’autre méthode expérimentale n’impliquant pas d’animaux vivants et permettant d’étudier le développement et la complexité du cerveau. Ces analyses nécessitent l’utilisation de souris : le comportement des neurones diffère selon leur environnement, ils adoptent un comportement migratoire in vivo et de croissance neuritique en culture; l’organisation laminaire du cortex (zone spécifique du cerveau), et les connexions neuronales qui y sont formées ne peuvent être reproduits en culture; la complexité des interactions entre les différents types cellulaires du cortex. Ainsi les modèles in vitro sont insuffisants pour étudier la complexité et la mise en place des réseaux neuronaux corticaux. La souris est un modèle de choix pour la transgénèse et les organismes génétiquement modifiés et nous avons à disposition plusieurs modèles murins de la maladie de Huntington. Nos modèles de souris ont été décrits comme reproduisant de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. Le but de ce projet étant de suivre l’impact des modifications ayant lieu au stade embryonnaire sur les stades tardifs, nous allons nous focaliser sur les âges suivants : chez l’embryon (jour de gestation 14 et 16) pour observer l’effet direct de la modification pendant l’établissement des couches du cortex cérébral, à un stade juvénile pour étudier la continuité du développement post-natal ; particulièrement à l’âge de 30 jours et à l’âge de 12 mois pour analyser la perméabilité de la barrière entre le sang et le liquide céphalorachidien; et à 3, 6, 8 et 12 mois pour évaluer les conséquences au stades adultes de la modification embryonnaire, en comparant le phénotype des souris traitées à celui des souris modèles de la maladie. Nous utiliserons des animaux reproducteurs adultes afin de générer les animaux nécessaires pour nos procédures. Les animaux générés seront prélevés pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours.