Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 17/01/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-664380)
Les souriceaux visés ont 1 à 3 jours, âge auquel l’os du crâne reste assez souple pour y enfoncer une aiguille sans incision. 972 souris nouveau-nées sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées, soit en cours d’étude si les points limites sont franchis, soit à la fin pour prélever leurs tissus. Chacune reçoit une injection intracérébrale de composé candidat sous anesthésie gazeuse, avec pour risques déclarés un retard de croissance, une absence de prise de poids jusqu’au sevrage, un rejet par la mère et une atteinte des mouvements spontanés ou du comportement de recherche de la tétée. Les mères et les souriceaux non traités, qui ne comptent pas dans les 972, sont soit utilisés pour la formation à des gestes techniques, soit basculés vers un autre projet d’évaluation de composés.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares (moins d’une personne atteinte sur 2000) est estimé à 3.5 millions. Plus de 7000 maladies rares, dont 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. L’atteinte pour certaines d’entre elles peut provoquer des signes cliniques pathologiques dès la naissance ou l’enfance (entre 3 mois et 6 ans), comme les encéphalopathies épileptiques et/ou développementales (Developmental Epileptic Encephalopathies ou DEEs). Les DEEs sont des maladies neurodéveloppementales rares, génétiques et syndromiques, caractérisées par une déficience intellectuelle, des troubles du langage, un développement moteur potentiellement altéré et des crises d’épilepsie d’apparition précoce, souvent accompagnées d’une régression du développement. Les traitements actuels (médicaments antiépileptiques) sont peu efficaces pour les formes rares, et les interventions chirurgicales sont lourdes et risquées chez les jeunes enfants. Il est nécessaire d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie et l’apprentissage des patients. Les composés étudiés, sélectionnés après des tests in silico et in vitro, sont testés chez la souris adulte afin d’évaluer leur tolérabilité et leur efficacité sur une cible d’intérêt. Les meilleurs candidats sont retenus et testés chez la souris nouveau-née (phases de développement cérébral similaire entre un souriceau de 3 jours et un nourrisson humain de 3 mois) afin d’évaluer leur effet dans le cadre du traitement des maladies épileptiques rares, et destinés à être administrés à de jeunes enfants (à partir de 3 mois). Il est essentiel d’évaluer l’effet de nos candidats médicaments pendant les stades de développement du cerveau où les crises épileptiques se manifestent le plus dans le cadre des DEEs. Les traitements pharmacologiques peuvent avoir des effets différents sur un cerveau en développement (nouveau-né) par rapport à un cerveau plus mature (souris sevrée, jeune adulte ou adulte). L’objectif de ce projet est de définir un modèle permettant d’administrer nos candidats médicaments dans des zones spécifiques du cerveau de souris nouveau nées âgées de 1 à 3 jours par voie intracérébrale. En effet, les candidats médicaments ne passant pas la Barrière Hémato-Encéphalique, nous sommes obligés de les administrer par voie intra-cérébrale.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les traitements de la DEE reposent sur la prescription de médicaments antiépileptiques, qui ne sont pas toujours efficaces pour les formes rares d’épilepsie, et sur des interventions chirurgicales curatives (ablation de la zone épileptogène, radiochirurgie cérébrale ou thermocoagulation) qui peuvent être lourdes et risquées notamment chez les jeunes enfants. Les futurs candidats médicaments évalués dans ce projet sont connus pour ne pas passer la Barrière Hématoencéphalique (barrière naturelle qui sépare le cerveau du reste du corps). Ils seront donc administrés directement dans le système nerveux central (SNC) des patients afin de permettre un ciblage direct de celui-ci, augmentant ainsi l’efficacité des traitements, et diminuant les effets secondaires qui pourraient survenir après une administration orale ou intraveineuse, améliorant ainsi grandement la qualité de vie des patients. Les bénéfices attendus de ce projet sont de caractériser les potentiels candidats médicaments et de déterminer leur efficacité sur une cible donnée dans le cadre de maladies rares neurologiques infantiles. Chez la souris, afin de mimer au mieux la voie d’administration humaine, les composés seront administrés par voir intracérébrale.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
– Administration de composés étudiés par voie intracérébrale sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 15 minutes – 1 seule fois en début d’expérience) – Administration sous-cutanée des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) et administration intra-péritonéale des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) avant l’euthanasie en fin d’étude.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : – Des administrations d’anesthésique Intra péritonéales en amont de la perfusion intra-cardiaque. La contention de 30s et l’administration d’environ 10s peuvent également générer un léger stress. De la phase d’anesthésie gazeuse (durée maximale de 20min) et du suivi post-anesthésie qui peuvent générer un stress modéré. De l’administration de composés par voie intra-cérébrale sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 30s qui peut générer un stress modéré. Une potentielle source de nuisance peut survenir lors : D’une non prise de poids des souriceaux jusqu’au sevrage pouvant être induite par l’administration du composé ainsi qu’un retard de croissance (nuisance modérée) Du rejet de la mère (nuisance modérée) Les composés administrés peuvent également induire des effets cliniques (par exemple atteinte des mouvements spontanés, retard du comportement de recherche de la tétée) et provoquer une nuisance pour l’animal (durée maximale de l’étude : 60 jours).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les souriceaux inclus dans les procédures sont soit euthanasiés en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiés en fin d’étude afin de réaliser des prélèvements de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques (effet des composés sur l’expression de la protéine d’intérêt par exemple). De plus, les mères ainsi que les souriceaux non-traités, non inclus dans les procédures de cette demande de projet seront soit utilisés pour de la formation à des gestes techniques, soit utilisés dans des études d’évaluation d’efficacité de composé faisant l’objet d’un autre projet autorisé.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, cellules souches…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal. Il est donc nécessaire que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal sain possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant d’évaluer l’activité de candidats médicaments pour le traitement de maladies neurologiques rares.
2. Réduction
Un premier filtre in vivo est effectué via une autre autorisation de projet afin d’identifier les meilleurs candidats médicaments pharmacologiquement intéressants. En effet, des études préalables permettront d’évaluer la tolérabilité des composés sur des souris adultes ainsi que leur efficacité sur une cible d’intérêt, afin de pouvoir sélectionner les candidats médicament les plus puissants. A l’issue de ce premier filtre, les administrations chez la souris nouveau-née pourront être réalisées sur un nombre restreint d’animaux (6 souris maximum par groupe) et sur des animaux des deux sexes (la détermination sexuelle ne pouvant être sûre qu’à partir de 21 jours) dans le cadre de l’évaluation pharmacologique des composés. Une consultation du service de Biostatistique sera effectuée après la réalisation des premières études afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par groupe mais en assurant l’obtention de résultats exploitable et reproductibles. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, une consultation statistique sera programmée pour réajuster le nombre d’animaux nécessaire ainsi que pour travailler sur le design expérimental le plus adapté. Lors des prélèvements effectués à la fin des études après euthanasie des souris, un maximum de tissus seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant ainsi la multiplication des analyses biochimiques et/histologiques potentiellement réalisables. Ce processus nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé par projet de recherche.
3. Raffinement
Les souriceaux seront stabulés avec leur mère jusqu’au sevrage (21 jours) puis maintenus en groupes sociaux une fois retirés de leur mère, dans un environnement adapté limitant au maximum les facteurs de stress (bruits, manipulations fréquentes …) et en séparant les mâles des femelles pour les études de plus de 21 jours. Phase d’administration (20 min max de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal) sous anesthésie générale gazeuse sur couverture chauffante. Aucune incision ne sera nécessaire pour insérer l’aiguille d’injection dans les ventricules – l’os du crâne étant encore souple chez un souriceau de 1-3 jours. Observation des souriceaux effectuée durant la phase de réveil et lors du replacement dans la cage avec la mère après un réveil complet. Une grille de score spécifique réalisée par une analyse comportementale (1h, 3h, 6h et 24h après administration) établira un score de tolérabilité des candidats médicaments. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites définis par la grille de score, sera euthanasié. Suivi de l’état général des animaux réalisé quotidiennement (durée max de 60 jours). Le suivi du poids sera réalisé 1 à 2 fois par semaine pendant les 10 premiers jours post-administration afin de limiter au maximum le rejet de la mère. Une estimation visuelle de la bonne croissance des souriceaux administrés sera effectuée en regard d’un animal contrôle non-administré. Pour diminuer les risques de rejet: – Mise en contact de la femelle gestante, dès son arrivée et jusqu’au début des études, avec les odeurs qu’elle rencontrera sur les nouveau-nés (solutions désinfectantes, gants…) – La cage d’une femelle qui vient de mettre bas ne devra pas être nettoyée pendant 2 semaines. Si un nettoyage ou un changement de litière est nécessaire au cours des premiers jours, le nid entier sera transféré dans la nouvelle cage. – Les administrations seront faites sur une première moitié de la portée puis sur la seconde afin que la mère ait toujours des nouveau-nés avec elle – Avant la réintroduction des souriceaux dans la cage de la mère après administration, ils seront frottés avec le nid souillé afin d’en être réimprégnés de l’odeur. L’hébergement sera enrichi : bâtonnet de coton et sizzle pad pour le nid en plus d’un tube en plexiglass et d’un bâtonnet en bois La phase de prélèvement se déroulera sous analgésie (buprénorphine 0.1ml/10g ou méthadone 10mg/kg en SC) et anesthésie profonde (kétamine 120mg/ml et de xylazine 12mg/ml en IP).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris saine présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’évaluer l’efficacité des composés sur les cibles génétiques sans avoir systématiquement recours à des souris génétiquement modifiées. Afin d’évaluer l’effet de nos composés dans le cadre des DEEs, il est important de développer des modèles vivo adaptés au stade de développement cérébral et physiologique des patients atteints. Ainsi, il s’avère nécessaire de réaliser les études sur des souris nouveau nées. Les procédures d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. Les administrations seront réalisées sur des souriceaux âgés de 1 à 3 jours. Afin d’évaluer l’effet de nos composés dans le cadre des épilepsies rares infantiles, il est important de développer des modèles vivo adaptés au stade de développement cérébral et physiologique des patients atteints. Ainsi, il s’avère nécessaire de réaliser les études sur des souris nouveau-nées.