Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-02-09 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-675643)
2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On les infecte par le virus de la grippe puis, au septième jour, par le pneumocoque, une surinfection qui provoque troubles respiratoires, perte de poids et prostration et tue en deux à trois jours si elle n’est pas arrêtée, les instillations se faisant sous anesthésie parfois par incision de la trachée. Le porteur cherche à comprendre pourquoi les macrophages pulmonaires réagissent différemment chez la souris et chez l’humain, et à tester des molécules immunomodulatrices dont un brevet est en cours. Il affirme qu’aucun modèle in vitro ne reproduit la tolérance d’un « organisme entier », tout en décrivant des travaux sur tranches de poumon humain censés réduire le recours aux animaux.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Chaque année, la grippe saisonnière infecte plus d’un milliard de personnes (environ 20 % de la population mondiale). La versatilité de l’efficacité vaccinale, et l’absence d’antiviraux efficaces, peine à juguler les 500 000 décès annuels dus à la grippe. Cependant, lors d’une infection grippale, la morbi-mortalité n’est pas attribuée seulement au virus influenza, mais aussi à des co-infections bactériennes (40% dans notre service de réanimation). Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque) est le principal agent de ces co-infections, responsable de la sévérité de l’infection et de décès potentiels. Les macrophages alvéolaires (MAs) sont essentiels dans la défense contre les infections à pneumocoque. Une déplétion des MAs chez des souris avant une infection par le pneumocoque entraîne une multiplication bactérienne dans les poumons 100 fois plus élevée par rapport au groupe témoin. Pourtant, une infection grippale chez les souris diminue la population des MAs d’environ 80%. Nous avons mené une étude observationnelle chez l’homme pour confirmer et quantifier la déplétion des MAs après une infection grippale (étude multicentrique). Surprenamment, la quantité de MAs reste stable lors d’infections grippales chez l’homme, remettant en question nos connaissances actuelles sur le rôle des MAs. Notre objectif est de comprendre cette différence souris-homme. Nous souhaitons étudier des modèles de souris plus proches de la réalité humaine : dose virale faible, souris plus âgées, souris avec expérience d’infections antérieures. L’exposition à des composés microbiens façonne le développement et la fonctionnalité du système immunitaire, influant sur la réactivité des MAs aux défis ultérieurs par un phénomène appelé immunité entraînée. Nous avons récemment découvert qu’une reprogrammation métabolique des MAs pouvait altérer leurs propriétés immunitaires, et nous souhaitons étudier ce phénomène chez la souris (et chez l’homme) lors d’une surinfection grippale à pneumocoque. Enfin, nous avons démontré que certaines modifications métaboliques induites par le virus influenza pouvaient être inversées, notamment par l’ajout de succinate ou d’autres molécules immunomodulatrices (Demande de brevet en cours). Nous souhaitons évaluer si ces molécules pourraient représenter une nouvelle piste thérapeutique pour lutter contre les surinfections grippales à pneumocoque.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’infection grippale est un problème de santé publique majeure ; chaque avancée dans notre compréhension est importante. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle préférentiel pour l’étude des pathologies respiratoires humaines. Nous avons récemment mis en évidence que l’une des faiblesses de ce modèle réside dans la différence entre les macrophages alvéolaires (MAs) murins et humains. Les MAs sont l’une des cellules les plus impliquées dans l’immunité pulmonaire, notamment dans les co-infections bactériennes, responsables de la gravité des présentations cliniques chez l’homme lors d’une infection grippale. Cette différence peut biaiser les recherches effectuées dans ce domaine et limiter la translation souris-homme des thérapies. Ainsi, nous proposons d’améliorer le modèle murin d’infection grippale et de surinfection bactérienne en nous rapprochant de la relevance humaine. Nous espérons que les résultats issus des expériences décrites ici vont faire rapidement progresser nos connaissances et fournir de nouvelles pistes de compréhension sur le rôle des MAs dans cette pathologie. Ce projet permettra d’améliorer la translationalité des recherches dans le contexte des pathologies respiratoires, et notamment des thérapies antigrippales. De plus, nous possédons déjà des molécules immunomodulatrices qui ont démontrées leur intérêt thérapeutique sur un modèle de cellules épithéliales infectées par le virus de la grippe, ainsi que sur un modèle murin d’infection in vivo. Certaines de ces molécules ont notamment un effet protecteur sur les MAs infectés par le virus de la grippe. Ces molécules proviennent d’un nouveau concept de défense immunitaire, l’immunometabolisme ; présentant plusieurs bénéfices attendus : Ces molécules naturelles et endogènes de l’homme (et non des drogues de synthèse), ont des propriétés antivirales à large spectre ainsi qu’un potentiel anti-inflammatoire puissant. Cette double action diminue le risque de résistance ; et permet de conserver un effet thérapeutique protecteur même dans le cas d’une instillation tardive, à l’inverse des molécules antivirales actuellement sur le marché. Pour l’ensemble de ces raisons, l’étude des MAs représente une avancée majeure pour lutter contre la grippe, pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement efficace.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Toutes les souris seront anesthésiées, par injection intrapéritonéale, 3 ou 4 fois selon les groupes, pour une durée quelques minutes à chaque fois, durant lesquelles elles recevront soit une instillation intranasale soit une instillation intra-trachéale. Cette dernière nécessite une petite incision en haut de la trachée. Ces instillations ne durent que quelques secondes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’anesthésie générale nécessite une contention pour l’injection intrapéritonéale ce qui peut engendrer du stress pour les animaux ainsi qu’une légère douleur au niveau du site d’injection. Cette anesthésie peut également entrainer un refroidissement de l’animal. Les instillations pulmonaires intranasales et intratrachéales provoquent un stress pulmonaire qui se caractérise par une respiration saccadée et accélérée pendant 1 ou 2 minutes. Le liquide est ensuite rapidement absorbé par les tissus et lors du réveil de la souris, la respiration est revenue à la normale. L’instillation intratrachéale nécessite une petite incision en haut de la trachée. Notre modèle d’infection grippale à faible dose virale entraîne des dégâts pulmonaires qui peuvent fragiliser l’animal à partir du 7ème jour post-infection. La surinfection bactérienne a lieu au 7ème jour chez la souris et provoque une infection qui, si elle n’est pas contrôlée, aboutie à la mort des animaux en 2 à 3 jours. Le cumul de ces infections va induire une altération modérée de longue durée, affectant le bien-être et l’état général des animaux (troubles respiratoires, une perte de poids et une réduction de l’activité, température corporelle abaissée, prostration, fermeture totale ou partielle des yeux).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que le modèle murin d’infection par le virus de la grippe est bien établi et maîtrisé par l’équipe. Par contre, un effort important est fait pour remplacer certaines explorations in vivo par la mise en place de différents modèles de macrophages alvéolaires in vitro et ex vivo (macrophages alvéolaires), pour étudier les altérations immunométaboliques induites par le virus de la grippe. Enfin, certaines explorations sont directement faites chez l’homme quand cela est possible (culture ex vivo de macrophage alvéolaire humain, coupe de poumon issue de pièce opératoire).
2. Réduction
Premièrement, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour chaque condition, nous allons utiliser une technique d’instillation par la trachée. Cette technique permet une instillation dans seulement l’un des deux lobes pulmonaires. De fait, la souris représente son propre contrôle, divisant ainsi par deux le nombre d’animaux requis. Cette technique a été apprise lors d’un séjour d’étude à l’étranger et nous souhaitons la mettre en place dans notre laboratoire pour limiter le nombre d’animaux et les variations interindividuelles. Secondairement, nous allons récupérer les macrophages alvéolaires issus des souris entraînées ou traitées par des métabolites pour les cultiver en laboratoire. Cela permet de réaliser plusieurs types de tests sur des MAs issue d’une seule souris, limitant ainsi l’utilisation des animaux. Ajouté à cela, nous développons actuellement des modèles de tranches de poumons humains et murins. Cette technique, permet de réaliser un grand nombre de tranches de poumons à partir d’un seul donneur (environ 20 tranches par poumon de souris). Ce modèle permet à la fois de conserver la structure pulmonaire et la diversité cellulaire. Ainsi, cela permet la réalisation d’un grand nombre de tests au plus proche de la physiologie pulmonaire, réduisant le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, mais suffisant pour pouvoir réaliser les tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …).
3. Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. A l’arrivée des souris dans l’établissement d’hébergement, une habituation de 7 jours sera réalisée avant toute manipulation. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Toutes procédures d’instillation intranasale ou intra-trachéale seront précédées d’une anesthésie des souris par voie intrapéritonéale ou gazeuse pour les animaux déjà infectés. L’état de sédation de l’animal suivant ces anesthésies sera de maximum 20 minutes. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les animaux ayant atteint le point limite seront euthanasiés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous utiliserons la souris. Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris. Cette espèce est la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires, réduisant le besoin d’animaux pour des études préliminaires. Les souris sont facilement infectables par des souches adaptées de virus de la grippe humaine et présentent des symptômes cliniques similaires à l’homme (anorexie, hyperinflammation pulmonaire, perte de poids et mortalité). Les souris sont les plus couramment utilisées dans les études de physiopathologie et mécanistiques, mais également pour le développement d’outils thérapeutiques. Cette souche est appropriée pour étudier l’inflammation et les réponses immunitaires et est un modèle bien établi d’infection grippale. Les MAs de ces souris semblent plus résistants à l’infection grippale, se rapprochant de la réponse des MAs humains. Enfin, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8 semaines pour avoir un système immunitaire mature. Afin d’avoir des souris correspondant à l’âge moyen humain de notre étude (64 ans), des souris agées de 24 mois seront également utilisés.