Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-09-19 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-688888)
584 souris, dont des nouveau-nés, vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu’à sévère. Dès la naissance, elles reçoivent des injections dans le cerveau, certaines subissant à partir du cinquième jour une chirurgie avec pose d’une fenêtre optique et injection d’un virus de la rage modifié, avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le porteur indique que les petits opérés, incapables de se nourrir et rejetés par leur mère, sont euthanasiés et leur cerveau prélevé. Il affirme que ce réseau ne peut pas s’étudier hors de l' »organisme entier » et qu’aucune méthode de substitution n’existe, concluant à la nécessité de la souris.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif est double. Tout d’abord il est de comprendre comment le réseau hippocampique se développe en condition saine. La seconde partie du projet est de comprendre, a partir de la base que nous aurions déjà établie, comment ce circuit dysfonctionne pour plus tard donner des pathologies tel que l’Autisme. Plus particulièrement nous étudierons, au cours du développement postnatal, les modifications de l’innervation périsomatique à la suite de la perturbation de l’activité des interneurones. Nous testerons ensuite l’état de cette inhibition a diffèrent stade du développement ainsi qu’en condition pathologique (modèles d’autisme). Par ailleurs, l’activité des neurones de l’hippocampe est significativement associée aux mouvements pendant la première semaine de vie post-natale. Nous faisons l’hypothèse qu’en inhibant les voies extra-hippocampiques, nous réduirons la corrélation entre les mouvements spontanés et l’activité synchrone de CA1 et perturberont la maturation de la dynamique hippocampique. Afin de mieux connaitre le développement du connectome des neurones GABAergiques ou glutamatergiques de CA1, nous réaliserons des traçages neuronaux rétrogrades transynaptiques grâce à l’utilisation du virus défectif de la rage.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet de recherche est important car en plus de décrypter les mécanisme anatomique et fonctionnel par lequel les neurones PV contribuent à la dynamique de CA1, il nous a permis de comprendre les règles qui régissent le développement de l’hippocampe. Cette partie fondamentales du projet est indispensable pour comprendre ce qui dysfonctionne dans des pathologie neurodéveloppementale tel que les TSA. Par nos experience de manipulations du circuit, nous esperons potentiellement contrebalancer les dysfonctionnement observé dans les modèles de TSA.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Procédures chirurgicales tels que injections intraventriculaire, injection intra hippocampiques, pose d’une fenêtre optique pour l’imagerie à deux photons des neurones de l’hippocampes (492 animaux). Perfusion intracardiaque : Les animaux seront perfusé après une analgésie (burprenorphine 6,6ml/kg d’une solution 0.015mg/ml; 0.1mg/kg, IP) suivie 30 min plus tard d’une anesthésie profonde (Domitor à 0.9mg/kg et Zoletil 60mg/kg) (92 animaux, environs 33 mins/animale en comptant le temps d’action de l’analgésie et de l’anesthésie).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Comme décrit dans la procédure 1, les animaux subiront des injections stéréotaxiques a P0 puis, pour certains d’entre eux, une chirurgie à partir de P5. Dans le cas des injections stéréotaxique, l’animale est en dehors de la portée et de sa mère pendant 15 minutes. En ce qui concerne les chirurgies faites à partir de P5 les nuisances sont les suivantes : Stress préopératoire, douleurs per et postopératoire.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort. Procédure 1, 2, 4 : Ayant subie une chirurgie lourde, les animaux auront du mal à se nourrir, se déplacer, et à être accepter par leur mère. Ils ne seront donc pas remis dans leur portée, et par conséquent, euthanasié et leur cerveau prélevé pour éventuellement faire des vérifications histologiques.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude des réseaux corticaux, de par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peuvent pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme. C’est dans ce contexte que se situent nos travaux dont l’objectif est d’étudier l’organisation morpho-fonctionnelle de la mise en place des activités corticales de l’échelle cellulaire à l’échelle du réseau. REMPLACEMENT: il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode de substitution in vitro ou en culture cellulaire pour étudier la mise en place au cours du développement des activités neuronales du réseau hippocampique où informations externes et internes sont impliquées.
2. Réduction
2) REDUIRE: Les expériences seront réalisées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux. La méthode utilisée d’imagerie calcium in vivo permet l’enregistrement d’un très grand nombre de neurones (plusieurs centaines) par animal, et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Une même portée sera utilisée par plusieurs expérimentateurs. Les nouveau-nés non utilisés pour les études développementales seront utilisés plus tard dans le cadre d’études menées chez l’adulte.
3. Raffinement
RAFFINER: Le bien-être des animaux, qu’il s’agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés au cours des chirurgies pour réduire douleur et stress (anesthésie générale et locale, tapis chauffant, suivi strict postchirurgie des nouveau-nés en particulier après leur réintroduction au sein de la portée). Les mères et leur nouveau-nés opérés ou non seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi d’igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux femelles de faire des nids
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les raisons de l’utilisation de modèle murin sont multiples (Martinez-Cerdeno et Noctor, Août 2018, J Comp Neurol). Concernant nos expériences, les souris présentent une organisation morpho-fonctionnelle suffisamment complexe et évoluée pour en tirer des conclusions générales sur la mise en place développementale de la dynamique des réseaux corticaux. L’existence de nombreuses et différentes lignées transgéniques permettent de cibler telle ou telle sous-population de neurones. De plus, le modèle murin est couramment utilisé en neuroscience rendant nos résultats intéressants pour une large communauté scientifique et permettant de mieux les confronter aux résultats déjà publiés. Les animaux seront injectés entre P0-P3 dans le ventricule latéral, le cortex, l’hippocampe, le thalamus ou le septum, avec des virus (AAV) permettant l’expression de sondes calciques (GCamP, GECO….), d’outils optogénétiques (channelrhodopsine, halorhodopsine….), d’outils chémogénétiques (DREADD receptors…), de marqueurs fluorescents (GFP, Td-Tomato..), de traceurs rétrogrades transynaptiques. De 3 jours à deux semaines après l’injection, les animaux seront soit : 1) opérés afin de procéder aux expériences in vivo d’imagerie calcique (pose de fenêtre optique) ou d’enregistrements électrophysiologiques (insertion intracérébrale d’électrodes; 2) injectés en sous-cutané (10µl/g d’animal), en chronique ou en aigu, avec un solution de CNO diluée à 1mg/1ml avant d’être opérés pour poser une fenêtre optique et/ou électrode pour l’enregistrement des activités neuronales in vivo ; 3) injection à P5 ou P9 du virus défectif de la rage (SADdeltaG); 4) profondément anesthésiés puis perfusés par voie intracardiaque avec une solution fixative pour l’analyse morphologique.