Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/01/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-738173)
108 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui reproduit le syndrome de Stormorken et subissent des sections répétées du bout de la queue pour mesurer le temps de saignement, ainsi que des prélèvements sanguins à la veine cave, pour comprendre le phénotype hémorragique de la maladie. Le porteur précise que la lignée développe un déficit musculaire et hématologique mortel vers 32 semaines, mais fixe les procédures avant 20 semaines. Il qualifie le modèle murin d' »irremplaçable » au motif que l’hémostase ne serait pas modélisable in vitro.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les plaquettes sont des acteurs essentiels du maintien de l’intégrité vasculaire. Elles sont les premiers éléments cellulaires à intervenir dans l’arrêt du saignement lors d’une blessure vasculaire en participant à la formation d’un thrombus, ceci constituant l’hémostase physiologique dite primaire. Des problèmes de saignements plus ou moins graves peuvent être dus à des défauts de production et de fonctions plaquettaire. La mutation gain de fonction de la protéine STIM1 R304W/+est associée à une anomalie de l’homeostasie calcique intra-cellulaire dont les conséquences sont une modification de la production et de la fonctionalité des plaquettes. Notre étude vise à décrypter les mécanismes moléculaires et cellulaires permettant de comprendre le phénotype hémorragique dû à cette mutation de STIM1.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra d’un point de vue fondamental de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires du role de STIM1 dans la production et la fonction plaquettaire. D’un point de vue clinique, ce projet permettra de comprendre l’évolution de la maladie hémorragique chez l’homme.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Une coupure (de 3 secondes) de 3 mm du bout de la queue de la souris anesthésiée par injection IP (intra-péritonéale) est réalisée. Le temps d’arrêt de saignement (évalué à 50μl maximum de sang avant l’arrêt du saignement) sera évalué jusqu’à 20 minutes maximum. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé au niveau de la veine cave inférieure après anesthésie par injection IP . La prise de sang dure 1-2 minutes et un volume de sang de 800 à 1000 μl est prélevé. La souris est anesthésiée par anesthésie gazeuse et injectée en IP avec un anti-douleur pour un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) suite à une coupure de 1 mm (de 3 secondes). Nous réalisons ensuite une injection IP du composé d’intérêt inoffensif et non irritant. Six prélèvements sanguins à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute), suite à une coupure de 1 mm (durée de 3 secondes) est réalisé après anesthésie gazeuse et injection d’un anti-douleur sur une durée de 280h. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. Une injection d’un composé inoffensif et non-irritant est réalisée en intra-veineux pendant 10 secondes sur souris anesthésiée par anesthésie gazeuse. 1 heure après l’injection, puis toutes les 24 heures pendant 4 jours, un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) par coupure de 1 mm (durée de 3 secondes), est réalisé sur l’animal sous anesthésie gazeuse et injecté en intra-péritonéal avec un anti-douleur. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le modèle murin génétiquement modifié STIM1 R304W/+ qui mime la pathologie humaine présente un déficit musculaire et hématologique qui entraine la mort à partir de 32 semaines de vie. Cependant toutes les procédures expérimentales seront réalisées avant 20 semaines. Pour les procédures expérimentales sur animaux vivants, les composés injectés ne sont pas irritables ou/et délétères (anesthésiques, anti-douleurs et anticorps). Les produits injectés ont déjà été utilisés par différents laboratoires, dont le nôtre, et n’ont montré aucun effet indésirable. Ces injections n’induisent qu’une légère douleur au moment de la piqûre et un stress qui ne durent que 5 à 10 secondes.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car toutes les procédures nécessitent des prélèvements de sang et/ou d’organes.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexicité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré d’hémostase et thrombose non modélisable par des approches in vitro et (ii) l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés.
2. Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum : en suivant des protocoles expérimentaux déjà établis dans le laboratoire, en tenant compte d’expériences déjà réalisées dans l’équipe qui nous ont montré que nous pouvons obtenir des résultats statistiquement corrects en faisant des groupes de 12 souris pour chaque procédure réalisée. Nous nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables en évitant la répétition d’études antérieures déjà réalisées et/ou publiées et en fonction des résultats obtenus au cours des différentes procédures expérimentales. Nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 4 animaux nous permettant de définir s’il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes, qui si elles existent, seront statistiquement affinées avec des groupes de 12 souris par procédure. L’approche statistique permettra d’analyser les différences obtenues entre groupes.
3. Raffinement
Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson avec du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois dans la cage. Une observation quotidienne des souris est réalisée par les zootechniciens ou les responsables du projet en terme de comportement général (prostration, activité anormale, isolement) et d’apparence (poils hérissés, plaies/blessures, amaigrissement anormal). Toutes les personnes impliquées dans ce projet (zootechniciens et les responsables de projet) sont formées et qualifiées au respect des conditions du bien-etre animal et diplômées en expérimentation animale. Toutes les procédures expérimentales se font sur souris anesthésiées et analgésiées sauf pour les injections intrapéritonéales qui sont des gestes rapides de moins de 10 secondes sur animaux vigiles. Un contrôle permanent de l’état d’anesthésie des souris sera réalisé par les expérimentateurs tout au long de la procédure. Tout au long des procédures, les animaux seront surveillés par les zootechniciens et les expérimentateurs. En cas de blessure, l’animal sera isolé et la blessure sera nettoyée 2 fois par jour pour favoriser une cicatrisation propre. Une mise à mort rapide de la naissance à la mort ou lors d’une procédure expérimentale sera effectuée conformément à une grille de score définie.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous utilisons des souris car les mécanismes d’hémostase et thrombose sont transposables à l’homme mais aussi car nous disposons de modèles murins génétiquement modifiés invalidés pour nos protéines d’intérêt car il n’existe pas à ce jour d’inhibiteurs pharmacologiques. Stade adulte de 8 à 20 semaines car de part et d’autre de cette fourchette d’âge les réponses fonctionelles en hémostase et thrombose peuvent être modifiées.