Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 03/06/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-741874)
2 304 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tuées à l’issue et 60 réutilisées dans d’autres procédures ou d’autres projets. Une partie subit une chirurgie intracérébrale de vingt minutes sous anesthésie pour recevoir un candidat médicament, toutes passent par des prélèvements sanguins sur animal vigile et par des modifications du cycle lumière-obscurité, et les lignées génétiquement modifiées développent des troubles de l’équilibre, des tremblements et des dermatites, avec un point limite fixé à 20 % de perte de poids. À court terme, le projet cherche à vérifier que ces modèles murins reproduisent les troubles du sommeil observés chez les patients, l’amélioration de leur qualité de vie étant renvoyée au long terme. Le porteur conclut au caractère « indispensable » du recours à l’animal, les rythmes circadiens ne pouvant selon lui s’étudier qu’à l’échelle d’un « organisme entier ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les maladies rares neurologiques comme les ataxies spinocérébelleuses sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. Elles peuvent se manifester dès la naissance ou apparaitre chez l’adulte et, pour la majorité d’entre elles, aucun traitement curatif n’est actuellement disponible. Chez les mammifères, la majorité des processus biologiques, aussi bien sur le plan macroscopique que moléculaire, évoluent dans le temps en suivant des rythmes quotidiens précis. Le système nerveux intègre un grand nombre d’informations environnementales pour pouvoir mobiliser les ressources suffisantes et reconstituer les réserves aux moments opportuns. Les affections de ces rythmes appelés circadiens se matérialisent régulièrement par des troubles du sommeil et de la fatigue excessive pendant la journée. Ces symptômes sont très fréquents chez les patients atteints de pathologies neurodégénératives c’est pourquoi il est important de les étudier chez les modèles murins utilisés pour le développement de médicaments ciblant ces maladies. Ces modèles permettent de mettre en avant l’action bénéfique des traitements sur la pathologie et ses symptômes. Les symptômes de certaines pathologies sont reproductibles chez la souris à la suite d’altérations génétiques destinées à modifier le fonctionnement du système nerveux central. La souris présente une forte homologie génétique (90% des gènes humains ont un homologue chez la souris), physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. Chez la souris hébergée en animalerie, le paramètre environnemental qui a la plus grande influence sur le rythme circadien est la lumière. L’ensemble des autres paramètres (température, pression…) sont régulés et maintenus constants. La souris est une espèce nocturne : la majorité de son activité a lieu pendant la période d’obscurité, la période de lumière étant réservée au repos. Des conditions de basse luminosité ou d’obscurité totale sont favorables à la souris et limitent son anxiété. L’objectif de ce projet est d’identifier des défauts de rythmes circadiens chez des modèles murins de maladies neurologiques et d’évaluer la capacité de composés médicaments à diminuer ces affections. A long terme, l’objectif du projet est de participer à la mise au point de médicaments qui, en agissant sur leur cible, permettent de diminuer le plus grand nombre de symptômes, y compris ceux touchant les rythmes circadiens pour améliorer la qualité de vie des patients.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier des défauts de rythmes circadiens chez nos animaux modèles de maladies neurodégénératives et d’évaluer la capacité de nos candidats médicaments à restaurer ces modifications. A court terme, les résultats obtenus avec ce projet visent à prouver que les modèles animaux utilisés récapitulent correctement les troubles de rythmes circadiens retrouvés chez les patients. Ce projet permettra aussi de mettre en évidence un impact positif des composés médicaments testés sur la physiopathologie de la maladie chez la souris en plus d’avoir un effet au point de vue moléculaire identifié préalablement. Ces éléments ont pour but de renforcer les preuves d’efficacité des composés étudiés, en plus des données de tolérabilité et engagement de cibles obtenus plus tôt dans le processus de développement. A long terme, l’objectif de ce projet est de participer à la mise au point de médicaments qui, en agissant sur leur cible, permettent de diminuer le plus grand nombre de symptômes possibles, y compris ceux touchant les rythmes circadiens dans le but d’améliorer la qualité de vie des patients.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
• Administration des médicaments vétérinaires analgésiques par voies sous-cutanée ou intra-péritonéale (contention d’une durée maximale de 30s). Cela concerne 3 produits lors de la phase de chirurgie (5 administrations cumulées en pré et post opératoire) en cas d’administration intracérébrale de candidat médicament. La chirurgie pour l’administration intracérébrale est réalisée sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique comme décrit ci-dessus (durée maximale de 20 minutes – 1 seule fois au cours de l’expérience seulement en cas d’administration intracérébrale de candidat médicament). • Administration des médicaments vétérinaires analgésiques et anesthésiants en fin de procédure par voies sous-cutanée ou intra-péritonéale (contention d’une durée maximale de 30s). Cela concerne 2 produits lors de l’euthanasie en fin de procédure. • Prélèvement de sang sur animal vigile (1 fois toutes les 3-4 semaines pendant 11 semaines maximum) : o Contention d’une durée maximale de 2min o Piqûre de la veine marginale de la patte d’une durée maximale de quelques secondes o Prélèvement de sang d’une durée maximale de 30 secondes
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Une potentielle source de stress et/ou de douleur peut provenir lors : Avant et pendant les phases de chirurgie et d’euthanasie. Préalablement à ces étapes, des analgésiques et/ou anesthésiques sont injectés en sous-cutané ou intra-péritonéal (3 administrations pour la phase chirurgicale lors de l’administration intracérébrale de candidat médicament et 2 administrations en fin d’étude pour l’euthanasie). La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer un stress léger. La phase d’anesthésie générale gazeuse puis la chirurgie pour l’administration par voie intra cérébrale (1 chirurgie maximale d’une durée d’environ 20 minutes) et le suivi post-opératoire peuvent générer une douleur modérée. Des prélèvements de sang au niveau de la veine saphène de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer un stress léger. 3 prélèvements maximum sur animal vigile, espacés de minimum 3 semaines et répartis sur une durée de 7 semaines. De la modification du cycle lumière/obscurité pendant l’hébergement (stress léger). Une potentielle source de nuisance peut survenir lors : – D’une perte de poids limitée à 20% du poids de l’animal (nuisance modérée). De signes cliniques liés à l’expression du phénotype dommageable : les souris génétiquement modifiées miment les pathologies humaines et sont susceptibles de développer ainsi des signes cliniques évolutifs tels que des troubles moteurs (incoordination motrice, nuisance légère), des dermatites… (nuisance modérée).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Procédure 1 et 2 : maximum 10 animaux par groupe expérimental seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de fluides et/ou de tissus qui permettront de réaliser des analyses biochimiques. Minimum 6 animaux par groupes seront réutilisés : si la fenêtre d’expression du phénotype est toujours compatible et si les génotypes/sexes étudiés n’ont pas encore été mis en œuvre dans la procédure suivante, les animaux de la procédure 1 peuvent être utilisés pour la procédure 2 et inversement. Si la fenêtre d’expression du phénotype n’est plus compatible avec les procédures de ce projet ou si les génotypes/sexes étudiés ont déjà été mis en œuvre dans la procédure 1 et 2 de ce projet, les animaux seront réutilisés dans d’autres projets. Procédure 3 : toutes les souris sont euthanasiées en fin d’étude afin de réaliser des prélèvements de fluides et/ou de tissus qui permettront de réaliser des analyses biochimiques.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, cellules souches pluripotentes induites) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal mimant les troubles de la pathologie humaine. Il est donc nécessaire de valider les modèles physiopathologiques avant que les molécules les plus abouties dans leur développement ne soient administrées in vivo pour évaluer leur capacité à réduire les symptômes préalablement identifiés. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal (sain ou génétiquement modifié) possède des caractéristiques comportementales et neurophysiologiques permettant d’étudier des phénomènes comportementaux intégrés à l’échelle d’un organisme entier comme les rythmes circadiens. L’identification de modèles physiopathologiques qui récapitulent précisément les symptômes retrouvés chez les patients est critique afin de tester l’efficacité des nouvelles thérapies sur ces mêmes altérations. Le recours à l’animal est indispensable étant donné qu’une majorité des aspects physiopathologiques, en particulier des affections des rythmes d’activité, d’une maladie ne peuvent être récapitulés in silico ou in vitro.
2. Réduction
Les phases de caractérisation et de validation des modèles permettent d’appréhender le nombre d’animaux qui sera nécessaire pour les études d’efficacité de traitements pharmacologiques. Un accompagnement par le service des Biostatistiques sera assuré dans le but d’affiner le design expérimental. Le portoir de télémétrie connecté enregistre les données à l’échelle de la cage, sans discriminer le nombre et les animaux dans la cage. Cette spécificité limite donc la puissance statistique, l’unité de mesure (répliquât biologique) étant la cage et non pas l’animal. Il a ainsi été préféré un hébergement en binôme, soit le minimum permettant de ne pas faire d’hébergement individuel stressant pour l’animal mais permettant néanmoins de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’historique interne d’analyse des mesures d’activité générées par le portoir connecté suggère que des effectifs de 8 cages par groupe représente le minimum nécessaire pour observer des tendances ou des différences significatives sur les paramètres étudiés. La méthode de prélèvement de sang répété de faible volume, peu invasive et rapide, permet de prélever des échantillons de sang plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans le projet tout en respectant le bien-être les limites de volémies. Les études seront mises en place dans un premier temps et en priorité sur les lignées transgéniques et génotypes pour lesquels les informations historiques ou de la littérature existante suggèrent qu’ils peuvent mimer les symptômes des patients et donc nous apporter les réponses nécessaires aux questions scientifiques. Les animaux employés dans l’une des deux premières procédures seront réutilisés, après s’être assuré que les animaux sont correctement resynchronisés à un cycle lumière/obscurité classique, dans l’autre procédure (1 ou 2) seulement et seulement si la fenêtre d’expression du phénotype est toujours exploitable, si aucun prélèvement terminal n’est nécessaire et les souches/génotypes/sexes n’ont pas déjà été étudiés dans l’autre procédure. Si la fenêtre d’expression du phénotype n’est pas compatible avec une réutilisation dans une procédure de ce projet, les animaux seront réutilisés dans un autre projet. En cas de prélèvements effectués à la fin des études, un maximum de tissus et de fluides seront collectés sur un même animal après son euthanasie permettant la réalisation de nombreuses et différentes analyses biochimiques et/histologiques.
3. Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe de 2 dès l’arrivage et pendant toute la durée de l’étude, sauf si les caractéristiques et l’historique liés à la souche ne le permettent pas (agressivité), en accord avec les recommandations de la Structure de Bien-Être Animal (SBEA). Dans le cas d’un hébergement individuel suite à de l’agressivité, une mesure compensatoire est prévue par l’ajout d’un élément de nidification. Les recommandations en termes de limite d’âge ou de conditions de maintien émises par la SBEA seront appliquées aux souris génétiquement modifiées qui peuvent développer des signes pathologiques avec le temps. L’activité des animaux sera enregistrée en continu et de manière non-invasive grâce à l’hébergement des animaux dans des cages d’hébergement classiques insérées dans un portoir de télémétrie connecté. Les composés ne passant pas la barrière hématoencéphalique seront administrés chirurgicalement par voie intra cérébrale sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire favorisant une meilleure récupération de l’animal. Toute la phase chirurgicale, d’une durée d’environ 20 minutes (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal), se fera sur couverture chauffante puis pour le réveil dans des enceintes chauffées réduisant ainsi significativement le risque d’hypothermie. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien. Le suivi est accru pendant la période post-chirurgie, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation 1 heure après la chirurgie, des pesées quotidiennes pendant les 7 jours qui suivent l’opération et l’application de points limites éthiques adaptés à cette intervention le cas échéant. Ce projet bénéficie d’une expérience interne robuste et de données déjà existantes sur (i) l’utilisation des souris transgéniques ciblés dans ce projet, (ii) l’administration par voie intra cérébrale et (iii) l’analyse de l’activité des souris grâce au portoir connecté. Ces connaissances permettent de définir des mesures de raffinement cohérentes comme l’utilisation d’une grille de scoring post-chirurgie ou des soins appropriés en cas d’expression du phénotype dommageable. Lors de la mise à mort et si nécessaire la perfusion intra-cardiaque est réalisée après observation de l’arrêt respiratoire suite à l’injection létale de pentobarbital pour limiter la souffrance liée à ce geste.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
– La souris présente une forte homologie génétique et physiologique avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. En particulier, sur le plan comportemental, de nombreux modèles génétiquement modifiés ont été développés chez la souris, en miroir des fonctions cognitives, sensori-motrices et des états émotionnels de l’Homme en conditions physiologiques ou pathologiques. – Les procédures d’évaluation décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. – La souris est génétiquement modifiable et ce avec des techniques de plus en plus performantes, offrant une large palette de modèles pertinents pour l’identification de nouveaux biomarqueurs et cibles dans les maladies neurologiques rares. En accord avec les symptômes observés chez les patients des pathologies étudiées, les phénotypes présentés par certains animaux incluent des troubles de la démarche et de l’équilibre, une légère hypoactivité, de légers tremblements. Les souris seront utilisées du stade « jeune adulte sevré » au stade « animal âgé ». L’âge maximal des animaux pendant les procédures est de 12 mois. L’âge n’est pas une variable étudiée dans ce projet : aucune procédure ne vise à déterminer les différences d’affection des rythmes circadiens en fonction de l’âge des souris. Pour les lignées à phénotype dommageable les animaux adultes seront utilisés au plus tôt dans leur période symptomatique. La fenêtre d’expression du phénotype chez chaque souche est déterminée grâce à l’historique d’utilisation en interne et aux données de la littérature. Les animaux seront utilisés à un âge compris entre 2 et 12 mois de manière à couvrir l’ensemble des fenêtres d’expression phénotypique pour toutes les souches citées dans ce projet. L’âge d’utilisation dépend aussi des éventuelles recommandations en termes de limite d’âge qui pourront être émises par la Structure du Bien Être Animal.