Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 25/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-744570)
199 animaux non-humains, 162 souris et 37 rats, vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des matrices implantées sous la peau, les rats une ostéotomie du fémur avec injection d’un gel puis une thoracotomie terminale, pour tester des matériaux à base d’ARNm censés induire la réparation osseuse. Le porteur indique un risque de boiterie après la chirurgie osseuse et décrit la thoracotomie comme une procédure douloureuse réalisée sous fortes doses d’anesthésie en condition péri-mortem. Il affirme qu’aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la réparation osseuse et conclut au recours « nécessaire » à l’animal.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le processus spontané et naturel de réparation du tissu osseux est pris en défaut lors d’un traumatisme trop étendu, d’une non-consolidation, d’une résection osseuse de grande taille. Dans ces situations, l’autogreffe osseuse est le traitement de référence mais présente des inconvénients de morbidité et de quantité disponible. L’utilisation de biomatériaux est l’alternative usuelle pour la chirurgie orthopédique; néanmoins, ces matériaux inertes sont dépourvus de propriété biologique induisant la formation osseuse (dit ostéo-inductrice) limitant leur efficacité à la réparation de défaut de petite taille. Une approche en médecine régénérative osseuse consiste à rendre ces matériaux implantables biologiquement actifs, en leur associant des molécules induisant la formation osseuse. Les molécules les plus connues pour induire de l’os sont les protéines de la morphogénèse osseuse ou Bone Morphogenetic Proteins (BMPs). La BMP2 délivrée sous forme de protéine est/a été utilisée en clinique dans certaines pathologies mais se heurte à des effets secondaires importants en raison des fortes doses utilisées ; elle a d’ailleurs été retirée du marché dans de nombreux pays. Il est nécessaire d’évaluer de nouvelles alternatives à l’utilisation de BMP-2 sous forme protéique. Le projet propose d’évaluer le potentiel d’induction de formation osseuse de matériaux chargés non pas de protéines mais d’ARNm codant pour les protéines de BMPs (les ARNm sont des molécules, en principe produites dans les cellules, qui permettent de transformer l’information génétique situé dans l’ADN (dans le noyau) en protéines (cf https://www.afm-telethon.fr/glossaire/arn-messager-2717)); dans ce projet, nous synthétiserons l’ARNm codant pour différentes types de BMP et l’associerons à un gel ; l’utilisation d’ARNm présente de nombreux avantages tels que de délivrer des doses infiniment plus faibles qu’en utilisant des protéines de BMP. Une première étape consistera à évaluer le potentiel de différentes types de BMP (sous forme ARNm) à induire du tissu osseux en site sous cutané chez la souris (potentiel ostéoinducteur) ; cette évaluation se fera sur des animaux mâles et femelles pour évaluer l’impact du sexe de l’animal hôte sur la réponse biologique des BMPs. La seconde étape consistera à valider le potentiel de réparation d’u gel chargé d’ARNm codant pour la BMP la plus efficace dans un grand défaut osseux chez le rat.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
D’un point de vue technologique, notre projet donnera des données quant à l’intérêt de cette technologie à base d’ARNm pour une application d’ingénierie tissulaire. Pour la première fois, nous connaitrons le potentiel ostéoinducteur de différents homo- et hétérodimères de BMP (ces protéines sont composées de 2 sous-unités identiques (homodimère) ou différentes (hétérodimère)) délivrés sous forme d’ARNm en comparaison avec la stratégie actuelle en clinique, mais néanmoins controversée, consistant à utiliser la protéine recombinante rhBMP2. Nous obtiendrons aussi des véritables données sur l’influence du sexe de l’animal receveur (et donc présence ou non d’œstrogènes, hormones qui modulent la signalisation des BMP dans les cellules ostéoprogénitrices) sur la réponse des BMPs. Enfin, d’un point de vue médical, ce projet permettra d’évaluer une nouvelle stratégie pour la réparation de grands défauts osseux.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour les souris : 1-Implantation sous cutanées de matrices ( 1X ; durée ~30 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (4X; durée 15 min) 3- Imagerie en bioluminescence in vivo (8X; durée 40 min) Pour les rats : 1- Osteotectomie diaphysaire fémorale avec injection d’un gel ostéoinducteur (1X, durée 60 min) ; 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (6X; durée 15 min) ; 3- Thoracotomie suivie d’une perfusion intracardiaque d’un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les implantations sous-cutanées sont généralement bien tolérées chez la souris; il sera en éponge de collagène qui s’écrase. Un effet indésirable est l’élimination des points de suture trop rapidement (le lendemain) ; si la cicatrice est belle, rien ne sera fait ; si la cicatrice est mal fermée (> 2 mm), l’animal sera anesthésié sous isoflurane, et les bords seront recoupés et resuturés. Pour les implantations intra-osseuses, un risque est l’apparition d’une boiterie de l’animal post-chirurgie ; les animaux seront étroitement surveillés durant les 3 jours post-chirurgie. Il peut aussi arriver une faillite de l’ostéosynthèse (vis se dévissant); tous les animaux seront scannés toutes les 2 semaines, permettant de contrôler l’ostéosynthèse ; en cas de faillite, nous surveillerons étroitement la démarche de l’animal ; si une persistance de boiterie apparait, il sera mis à mort. Ce projet comprend aussi une thoracotomie en point terminal (ouverture de la cage thoracique pour accéder au coeur). La thoracotomie est une procédure douloureuse, aussi nous utiliserons des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet permettant des analyses post-mortem (analyse au μCT à une résolution de 9 μm + histologie des explants ou analyses de l’expression génique)
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire; à cela s’ajoute l’impact d’un système hormonal complexe . Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.
2. Réduction
Les études quantitatives nécessiteront 8 animaux pour obtenir un pouvoir statistique suffisant, compte tenu des variations de résultats pouvant être observées dans les études in vivo. Pour les études en site ectopique 4 implants ou 2 implants seront implantés par souris pour diminuer le nombre d’animaux. Pour les études en site ectopique 4 ou 2 implants seront implantés par souris pour diminuer le nombre d’animaux. L’imagerie noninvasive pour petits animaux (suivi de l’expression d’une protéine modèle luciférase par bioluminescence (phénomène d’émission de lumière telle qu’observée chez les vers luisants) et de la formation osseuse par microscanner) sera utilisée pour suivre les mêmes animaux dans le temps et permet ainsi de réduire le nombre d’animaux.
3. Raffinement
La souffrance sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant les 3 premiers jours. Après chirurgie, les animaux seront surveillés en per-opératoire puis régulièrement (2X/j pendant 3 jours, puis 1X/j pendant 3 jours puis finalement 2 X/semaine jusqu’à la fin de l’expérimentation). Pour chaque analyse (micro-scanner ou bio-imageur) les souris seront anesthésiées par inhalation à l’Isoflurane dont les effets se dissipent 1 à 2 minutes après l’arrêt du contact direct avec le produit. La thoracotomie est une procédure douloureuse, aussi nous utiliserons des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), dômes et papier afin de contribuer au fouissement des animaux. Les souris et rats initialement hébergés ensemble (3 animaux/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum. Les points critiques (plaie, démarche..) seront surveillés, scorés et reportés sur une feuille de score permettant d’objectiver la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures à prendre pour chaque situation clinique (Perte de poids, Comportement général altéré, Apparence extérieure altérée, Site d’implantation infecté, boiterie) et en cas d’atteinte des points limites sont listées sur cette feuille de score.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle animal choisi pour les implantations sous-cutanées est la souris Swiss. Le modèle souris permet d’évaluer le potentiel ostéoinducteur d’implants chargés d’un facteur de croissance induisant la formation osseuse (en particulier la Bone Morphogenetic Protein 2/ BMP2), aussi bien que le rat ; la souris a l’avantage d’être plus petite et moins chère. La souche SWISS est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin et donc diminuant le biais d’utiliser une population trop homogène ; par ailleurs, son poids à 8 semaines (~30 g) permet l’implantation de 4 implants par souris sans problème. Le modèle animal choisi pour les implantations intra-osseux est le rat Wistar. La taille du rat est plus pertinente que la souris pour évaluer la réparation d’un grand défaut osseux. La souche Wistar est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin. Pour les souris, jeunes adultes de 8 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30g et dont le potentiel de réparation osseux est optimal. Pour les rats, jeunes adultes (12 semaines) car de taille suffisamment importante pour permettre l’implantation en site osseux et leur phase de croissance est terminée.