Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 15/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-751778)
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures classées de souffrance sévère. Elles sont infectées par un virus influenza H1N1 par voie nasale, subissent des écouvillons buccaux, et servent notamment à déterminer une dose létale 50, c’est-à-dire la dose de virus qui tue la moitié des souris. Le porteur reconnaît une perte de poids pouvant dépasser 20 %, une détresse respiratoire sévère et une léthargie jusqu’aux points limites, et renvoie l’étude des mécanismes à des projets futurs. Il affirme qu’aucune méthode alternative n’existe, les modèles in vitro n’ayant pas selon lui la complexité d’une infection touchant plusieurs organes.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les populations virales sont confrontées à des goulots d’étranglement (événements réduisant la taille de la population virale et, par conséquent, sa diversité génétique) qui peuvent être divisés en deux catégories : les goulots d’étranglement de transmission et les goulots d’étranglement au sein de l’hôte. Des travaux menés par notre équipe sur les virus influenza aviaires, et par d’autres équipes sur les virus influenza humains, ont suggéré que la réponse immunitaire innée imposait un goulot d’étranglement majeur, prévenant l’émergence des variants minoritaires. Pourtant, ceci n’a jamais été formellement démontré expérimentalement. Pour le faire, nous souhaitons utiliser comme virus modèle un virus influenza WSN H1N1, typiquement utilisé en laboratoire. A partir de ce virus, nous avons obtenu trois mutants, possédant un avantage sélectif moindre en culture cellulaire : en comparaison à la souche sauvage, ils se répliquent de manière moins efficace in vitro. Nous avons ainsi un virus adapté aux mammifères (la souche sauvage, que nous souhaiterions utiliser comme variant minoritaire) et plusieurs virus avec un désavantage sélectif, à utiliser comme variants majoritaires. Nous souhaitons ainsi reproduire le phénomène suivant : un mammifère est infecté par un virus aviaire (donc peu adapté aux mammifères) ; au cours de la réplication de ce virus, un variant possédant une mutation d’adaptation aux mammifères apparaît. Ce variant est donc minoritaire par rapport au virus initial : pour que son émergence soit réussie, il doit devenir majoritaire et ainsi échapper au goulot d’étranglement imposé par la réponse immunitaire. Les caractéristiques phénotypiques d’un virus peuvent être différentes entre les modèles in vivo et in vitro : une mutation peut conférer un avantage sélectif à un virus lorsqu’il infecte un tapis cellulaire, sans que cette mutation ait d’impact sur la physiopathologie d’une infection in vivo. Des expériences sont nécessaires pour caractériser in vivo le virus sauvage et ses variants, et répondre aux objectif suivants : – Confirmer que le virus sauvage a un avantage sélectif par rapport aux virus mutés. – Déterminer les doses létales 50 (cet indicateur mesure la dose de virus causant la mort de 50 % d’une population animale donnée dans des conditions d’expérimentation précises) – Déterminer les organes dans lesquels les virus se répliquent préférentiellement.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet nous permettra d’identifier un ou plusieurs marqueurs d’adaptation aux mammifères du virus H1N1 étudié dans le modèle souris : nous confirmerons ou non que les mutations identifiées in vitro ont un impact in vivo. Si cela était bien le cas, nos mutants causeront moins de mortalité et se répliqueront moins efficacement chez la souris. Les mécanismes conférant les avantages sélectifs apportés par ces mutations seront étudiés dans les projets futurs, afin de mieux comprendre les déterminants moléculaires de l’adaptation des virus influenza aux mammifères.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront infectés par inoculation intranasale du virus après sédation préalable. Les seuls prélèvements effectués sur des animaux vivants seront les écouvillons oropharyngés : il s’agit d’un prélèvement rapide, simple et indolore, où un écouvillon en coton vient frotter l’intérieur de la bouche pour prélever de la salive.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les effets indésirables suivants peuvent être observés jusqu’à atteinte des points limites préalablement définis : perte de poids supérieure ou égale à 20 %, dyspnée sévère, réduction de la mobilité, léthargie.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Certains animaux seront euthanasiés pour que leurs organes soient récoltés. Les animaux survivant pour lesquels une autopsie n’est pas nécessaire ne pourront pas être adoptés, ayant été infectés par des virus influenza. Leur réutilisation ne sera pas possible, car les animaux auront développé une réponse immunitaire vis à vis des virus que nous étudions.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il n’existe aucune méthode alternative permettant d’étudier les interactions entre variants dans différents tissus et l’impact de la réponse immunitaire innée. Les méthodes in vitro et ex vivo n’ont malheureusement pas la complexité d’une infection multiviscérale.
2. Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est déterminé de façon à pouvoir évaluer par des tests statistiques les différences entre les groupes d’animaux : selon les données étudiées, des groupes de 5 ou 6 animaux sont suffisants.
3. Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, les mesures suivantes sont appliquées : – Les souris seront hébergées par groupes de 6 dans la première procédure et par groupe de 5 dans la seconde (les cages que nous possédons, de la marque Allentown, permettent d’héberger jusqu’à 6 animaux). – Application de conditions d’ambiance en accord avec l’âge et l’espèce (température, éclairage, hygrométrie). – Fourniture d’eau et d’aliment (adapté aux besoins d’entretien ou de croissance des souris) sans restriction et avec enrichissement (abris en cellulose, tunnels en plexiglass, cylindres en coton). – Manipulation des souris et contrôle de l’état des souris deux fois par jour par du personnel qualifié : cette surveillance permettra notamment afin d’identifier les animaux pour lesquels une mise à mort est humainement nécessaire (les points limites définis pour chacune des procédures ayant été atteints). – Inoculation intranasale du virus réalisée après anesthésie intrapéritonéale.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est un excellent modèle pour évaluer la réplication des virus influenza. De nombreux réactifs sont également disponibles pour moduler la réponse immunitaire, ce qui n’est pas le cas des autres modèles animaux utilisés pour l’étude de ces virus. Souris Balb/c âgées de 4 à 6 semaines : il s’agit de la souche la plus utilisée pour les infections par les virus influenza et l’âge est bien adapté car les souris âgées de 4 à 6 semaines ont déjà un système immunitaire fonctionnel.