Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 23/06/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-757374)
16 000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée et les hétérozygotes gardés vivants pour la reproduction jusqu’à dix-huit mois. À deux mois, chaque poisson est anesthésié le temps qu’un morceau de nageoire caudale soit coupé au scalpel pour le génotypage, les poissons au génotype non recherché ou présentant un phénotype visible étant ensuite tués. Le porteur affirme que l’ablation d’un fragment de moins de 0,25 mm² reste sans conséquence et que la nageoire repousse en quinze jours. Il justifie l’usage du poisson zèbre par un cerveau de vertébré parmi les plus simples et affirme qu’aucun modèle in vitro ne peut le remplacer pour l’étude de la mémoire.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Comprendre comment les animaux apprennent et forment des souvenirs est une question fondamentale en neurosciences. Pour répondre à cette question des poissons zèbres sont utilisées car leur cerveau est relativement simple (~100 000 neurones), petit (0,25 mm3) et l’activité de tous les neurones peut être mesurée de façon indépendante. Lorsqu’il est stimulé par un flash de lumière ou un bruit, le poisson zèbre réagit par un sursaut. En cas d’éclairs ou de bruits répétés, cette réponse diminue, formant un type de mémoire connu sous le nom d’habituation. Ce projet consiste à génotyper des poissons zèbre âgès de 2 mois, issus de lignées à phénotype non dommageable afin de maintenir les individus avec un génotype voulu. Le génotypage se fera sur une biopsie de nageoire caudale
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’étude de l’habituation chez le poisson zèbre nous permettra de mieux comprendre les effets positifs de certaines voies de signalisation sur l »habituation et les mécanismes cellulaires mis en place lors de celle-ci. Les défauts d’habituation observés dans les cas de pathologies psychiatriques comme la schizophrénie ou l’autisme chez l’homme nous montrent l’importance de cette étude avec différentes mutations dans des protéines impliquées dans l’habituation.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les poissons âgès de 2 mois, seront génotypés par prélèvement d ‘une partie infime de leur nageoire caudale afin de ne garder que les individus voulus. Le génotypage sera fait par balnéation et anesthésie du poisson; un unique bout de la nageoire caudale sera découpée à l’aide d’un scalpel et transférée dans un tube. Le temps total de l’anesthésie sera inférieur à 2 min. Les poissons seront placés rapidement dans un bac de réveil rempli d’eau, surveillé jusqu’à leur réveil, avant d’être transférés dans leur aquarium. Les poissons sont maintenus deux par deux dans un aquarium avec un séparateur. Après génotypage, les poissons hétérozygotes sont maintenus dans les aquariums en nombre suffisant pour leur permettre de se déplacer en banc. Cette intervention concerne les 16 000 poissons de cette demande et n’aura lieu d’une seule fois à 2 mois.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le génotypage des poissons se fera par découpe d’une extrémité de la nageoire caudale d’une surface inférieure à 0.25 mm2 sous anesthésie dans un délai très court. Les nuisances ou effets indésirables se situent au moment de l’endormissement , du réveil ou de la non repousse de la nageoire (qui doit être totale au bout de 15 jours). Tout phénotype visible entrainera la mise à mort immédiate du poisson.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les poissons une fois génotypés seront divisés en deux catégories. Les poissons +/+ seront mis à mort car nous souhaitons maintenir les lignées sont forme hétérozygote. Les poissons hétérozygotes +/- seront maintenus en vie pour être mis en croisement afin de faire des expériences d’habituation sur leurs descendants âgés de moins de 5 jours et pour être mis en croisement pour obtenir la génération suivante 6 mois plus tard. Ces poissons +/- seront maintenus en vie jusqu’à 18 mois si aucun point limite n’apparait avant.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude de la mémoire et du comportement ne peut se faire que sur un cerveau entier, dans des animaux vivants. Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés. En tant que vertébrés, le cerveau et le génome du poisson zèbre partagent des homologies majeures avec les mammifères et les humains. Travailler sur un modèle vertébré est essentiel pour nos projets visant à découvrir les mécanismes conservés de plasticité et leur pertinence potentielle pour la fonction psychiatrique humaine et le dysfonctionnement du cerveau dans les maladies neurologiques. Aucun modèle cellulaire in vitro ne peut se substituer à cette étude. Nous utilisons des lignées transgéniques connues pour être impliquées dans l’habituation afin de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu et mieux caractériser l’action de certaines molécules impliquées dans les défauts de mémoire.
2. Réduction
Les lignées à génotyper sont sans phénotype dommageable même à l’état homozygote mais sont en plus maintenues sous forme hétérozygotes pour trois raisons. Nous devons les croiser avec les individus sauvages afin d’éliminer les mutations indésirables spontannées et la consanguinité. Les expériences de comportement, faites sur leur descendance âgés de moins de 5 jours, nécessite des poissons ayant tous les génotypes, génotypes possibles qu’en croisant des hétérozygotes par des hétérozygotes. Pour les poissons portant une simple mutation (lot1), nous devons garder à la naissance 50 embryons que nous laisserons se développer jusqu’à 2 mois avant de procéder au génotypage. Nous devons également maintenir les poissons doubles mutants sous forme double hétérozygote (lot2). Nous en garderons 100 au moment de leur naissance afin d’avpoir, après génotyapge 25 double mutants hétérozygotes (+/-;+/-).
3. Raffinement
Le génotypage sera fait par balnéation et anesthésie du poisson puis la nageoire caudale sera découpée . Le temps de cette étape durera moins de 2 min. Les poissons seront placés immédiatement dans un bac rempli d’un litre d’eau, surveillé obligatoirement jusqu’à leur réveil, avant d’être transféré dans leur aquarium. Une fois par jour des artémias vivants leur sont donnés en plus de deux nourritures sèches. Après le génotypage par PCR, qui durera moins de 48h, les poissons hétérozygotes sont regroupés et maintenus dans les aquariums en nombre suffisant (>8) pour leur permettre de se déplacer en banc. En plus de la nourriture sèche, une fois par jour des artémias vivants leur sont donnés afin de maintenir leur activité de prédation. A tout moment, tout poisson présentant un comportement anormal, ou un des points limites tels que fréquence operculaire/branchique, problème de flottabilité, immobilité, mouvements natatoires, mouvements anormaux suite à la coupure de la nageoire, non repousse de la nageoire, sera euthanasié immédiatement. Les poissons seront observés deux fois par jour au moment de leurs nourrissages.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés. En tant que vertébrés, le cerveau et le génome du poisson zèbre partagent des homologies majeures avec les mammifères et les humains. Travailler sur un modèle vertébré est essentiel pour nos projets visant à découvrir les mécanismes conservés de plasticité et leur pertinence potentielle pour la fonction psychiatrique humaine et le dysfonctionnement du cerveau dans les maladies neurologiques. le génotypage se fait à 2 mois car à ce stade la nageoire caudale est assez développée pour qu’un petit bout soit prélevé sans conséquences et que celle-ci repousse en l’espace de 15 jours.