Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-03-27 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-769947)
Pour savoir comment la lumière recale les horloges biologiques, 600 souris privées de certains photorécepteurs vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles passent quinze à vingt jours en obscurité constante, isolées en cage individuelle, sous un capteur infrarouge qui enregistre leur activité. Vient ensuite une injection dans l’œil sous anesthésie, un réveil d’une heure, trente minutes de stimulation lumineuse, puis la mise à mort une heure plus tard pour prélever les tissus. Le porteur annonce que les points limites « spécifiques au projet » seront appliqués, sans dire lesquels.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le fonctionnement autonome des horloges circadiennes repose sur des mécanismes impliquant des gènes d’horloges et leurs protéines, dont certains forment une boucle de rétroaction autorégulée, avec une rythmicité de 24 heures. L’horloge centrale du noyau suprachiasmatique, dont l’activité est synchronisée par la lumière via les photorécepteurs rétiniens, contrôle par des voies de sortie directes et indirectes, les rythmes de sécrétions hormonales, d’activité locomotrice, de température, de vigilance et le cycle veille/sommeil. En plus de son rôle synchronisateur de l’horloge centrale, la rétine contient également un oscillateur circadien autonome à l’origine de nombreux processus cellulaires, biochimiques, et physiologiques. Dans ce projet, nous évaluerons chez l’adulte et au cours du développement 1) les conséquences de l’absence spécifique d’un type de photorécepteurs sur le fonctionnement endogène des horloges (rétine et horloge centrale) et leur réponse à la lumière, 2) le rôle respectif des différents photorécepteurs sur la réponse à la lumière de ces horloges et 3) les voies de signalisation mise en jeu dans la transmission de l’information photique par les bâtonnets dans la rétine.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra de déterminer les conséquences de l’absence spécifique d’un type de photorécepteurs sur le fonctionnement des horloges circadiennes (rétine et noyau suprachiasmatique) et leur réponse à la lumière en utilisant des modèles murins transgéniques, déficients en photorécepteurs. L’altération de la réception de l’information lumineuse chez ces modèles devrait se traduire par des dysfonctionnements de nombreuses fonctions physiologiques des horloges. De plus, l’approche pharmacologique in vivo d’activation/inhibition des voies de signalisation des bâtonnets au sein de la rétine devrait nous permettre de décortiquer de manière précise les mécanismes par lesquels la lumière agit sur nos rythmes circadiens.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les interventions, d’une durée d’environ 3h30, sont listées ci-dessous : 1) Tout d’abord, les animaux adultes seront isolés dans des cages individuelles du début et jusqu’à la fin de l’expérimentation. 2) Les animaux adulte subiront, sous anesthésie générale et locale, une injection intravitréenne de molécules pharmacologiques avec réveil (1h). Après injection et réveil (1h), les animaux seront exposés à une stimulation lumineuse (30 min) et mise à mort 1h après la stimulation.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances : 1) Tout d’abord, les animaux seront placés individuellement dans des cages munies d’un capteur infrarouge permettant de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. 2) Afin d’évaluer les paramètres de leur système circadien (période endogène, décalage de phase comportemental), les animaux seront placés pendant 15-20 jours à l’obscurité constante. Le placement de l’animal en condition constante (obscurité constante) est le protocole standard utilisé afin d’évaluer le fonctionnement endogène et la réponse à la lumière du système circadien. 3) Les animaux subiront une chirurgie avec ou sans réveil.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Mise à mort pour prélevements de tissus et fin d’expérimentation.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le but de ce projet est de déterminer 1) les conséquences de l’absence spécifique d’un type de photorécepteurs sur le fonctionnement endogène des horloges et leur réponse à la lumière, 2) le rôle respectif de ces différents photorécepteurs sur la réponse à la lumière des horloges circadiennes. Compte tenu de la complexité de l’environnement tissulaire et le réseau complexe constituant les horloges circadiennes, ne pouvant être reproduits in vitro, ce projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal. De plus, ce projet fait appel à des modèles murins non transgéniques et transgéniques sélectionnés car ils permettent d’aborder différents aspects scientifiques de notre projet.
2. Réduction
Pour réduire le nombre total d’animaux: – Nous utilisons des approches non invasives (comportement) ne conduisant pas à la mise à mort de l’animal. -Ceratains animaux utilisés lors des approches noninvasives pourront être utilisés dans des approches ex-vivo. – Plusieurs prélèvements de tissus et certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. – Enfin, dans certains cas, chaque animal pourra être son propre contrôle. Le nombre d’animaux requis a été déterminé par une approche statistique.
3. Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la limitation du stress, au moyen notamment d’un enrichissement varié. Un suivi régulier des animaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort ou de douleurs. Les soins et les expérimentations seront réalisées par du personnel qualifié. Les points limites spécifiques au projet seront appliqués.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Ce projet fait appel principalement à des modèles murins non transgéniques ou modifiés génétiquement. Cette espèce a été sélectionnée car elle présente une grande similitude avec les photorécepteurs chez l’homme et représente donc un modèle expérimental privilégié pour l’étude des mécanismes moléculaires des horloges circadiennes et leur régulation par la lumière. De plus, elle permet d’avoir accès à plusieurs lignées dont le phénotype est bien établi. Les différentes souches sélectionnées sont pertinentes pour évaluer le rôle respectif des différents photorécepteurs, de l’horloge et des connexines dans le fonctionnement endogène et la réponse à la lumière des horloges rétinienne et centrale. Ces souris sont déficientes en : a) photorécepteurs : mélanopsine, opsine des cônes MW, ou bâtonnets. b) connexine 36 : invalidée dans les bâtonnets ou les cônes. c) Horloge dans les bâtonnets ou présentent une mutation conduisant à la dégénérescence des bâtonnets couplée à l’absence d’une horloge fonctionnelle dans les bâtonnets. Afin de mieux comprendre le fonctionnement moléculaire endogène et la réponse à la lumière des horloges circadiennes, des expérimentations chez l’adulte (2-5 mois) et le nouveau né sont indispensables. En effet, les horloges se mettent en place progressivement chez la souris durant la période post-natale. De plus, les différents photorécepteurs réceptionnant l’information lumineuse maturent progressivement et à des stades différents au cours du développement. Nous utiliserons différents stades postnataux : 8, 15 ou 30 jours après la naissance.