Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-775999)
260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l’ablation chirurgicale de la quasi-totalité des reins en deux opérations pour induire une maladie rénale chronique, puis des tests de tolérance au glucose et à l’insuline avec prélèvements sanguins répétés, pour évaluer un probiotique. Le porteur indique une mortalité chirurgicale de moins de 5% et prévoit la mise à mort en cas de glycémie hors seuil. Les retombées cliniques, un éventuel « essai thérapeutique chez l’homme », restent conditionnées à des résultats positifs.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie rénale chronique est un enjeu de santé publique majeur compte tenu de sa fréquence en constante augmentation et de ses conséquences en termes de décès. Elle est caractérisée par une diminution du fonctionnement des reins responsable de l’accumulation de déchets que le rein ne peut plus éliminer. Ces déchets sont appelés toxines urémiques et sont responsable d’une perturbation de la glycémie et de la progression de la maladie rénale. Le microbiote intestinal (bactéries de l’intestin) est responsable de la production de ces toxines urémiques issues de la dégradation des protéines de l’alimentation. Ainsi, la modulation du microbiote intestinal semble être une nouvelle stratégie thérapeutique pour réduire la production des toxines urémiques en plus des régimes pauvre en protéines proposés aux patients ayant une maladie rénale. Cependant réduire les protéines peut exposer les patients à un risque de dénutrition sévère et à des retards de croissance chez l’enfant. Les probiotiques qui sont des bactéries vivantes peuvent avoir un intérêt dans la maladie rénale en améliorant la composition du microbiote. Certains probiotiques semblent particulièrement intéressant. Par exemple, le probiotique Lactobacillus plantarum peut stimuler la croissance de souris juvéniles en condition de dénutrition. L’objectif de cette étude est d’étudier l’effet du probiotique Lactoplantibacille plantarum chez des souris ayant une maladie rénale chronique induite par chirurgie (ablation des 5/6èmes de reins, provoquant une maladie rénale chronique modérée) sous une alimentation pauvre en protéines chez des souris en croissance (souris jeunes) et chez des souris âgées. Nous cherchons à étudier l’impact de ce probiotique en particulier sur la croissance, la régulation de la glycémie, la fonction rénale et l’accumulation des toxines urémiques.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Cette étude nous permettra de mieux comprendre le rôle du microbiote intestinal dans la progression de la maladie rénale chronique, la production des déchets urémiques et leurs conséquences néfastes. Cela nous permettra de mieux définir si l’ajout d’un probiotique qui stimule la croissance et l’hormone de croissance, pourrait en plus de la modulation du microbiote lutter contre les effets délétères des régimes pauvre en protéines chez l’enfant et l’adulte. Si les résultats sont positifs, ce projet pourra faire l’objet d’un essai thérapeutique chez l’homme ayant une maladie rénale chronique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Le modèle de maladie rénale chronique sera induit par ablation chirurgicale des 2/3 du rein droit puis de la totalité du rein gauche 1 semaine plus tard. Chacune de ces opérations sera réalisée sous anesthésie générale et antalgie efficace. Le traitement antalgique sera poursuivi de façon systématique pendant 48 heures. Les chirurgies seront réalisées en conditions stérile et les souris seront installés sur des tapis chauffant afin d’éviter un refroidissement. Les souris contrôles auront une chirurgie factice au cours de laquelle le rein sera exposé selon la même procédure chirurgicale mais sans réaliser d’intervention au niveau du rein. Au cours de la chirurgie, l’opérateur vérifiera l’absence de saignement anormal. Les probiotiques seront administrés à la pipette dans la bouche des souris. Au cours de la procédure les animaux auront plusieurs prélèvements. Les prélèvements réalisés en condition vigile se feront par le biais d’une micro-incision à l’extrémité de la queue préalablement anesthésiée par crème anesthésiante locale. Un premier prélèvement sera réalisé avant la 1ère chirurgie et réitéré 3 semaines après la 2ème chirurgie. A 4 semaines, nous réaliserons un test de tolérance au glucose après 6 heures de jeûne. Le glucose sera injecté en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min. A 5 semaines nous réaliserons un test de tolérance à l’insuline après 6 heures de jeûne. L’insuline sera injectée en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min. La survenue d’une glycémie trop haute ou trop basse (malgré une injection intra-péritonéal de glucose) constitue un point limite et les animaux seront mis à mort selon la procédure (injection d’un anesthésiant à forte dose et dislocation cervicale). A 6 semaines, les souris seront placées 2 par 2, pendant 24 h en cage avec un fond contenant de trous millimétrique afin de récolter l’urine. A la fin de la procédure les souris seront mises à mort. Le dernier prélèvement sera réalisé à cœur battant, sous anesthésie générale afin de permettre le prélèvement d’un volume le plus grand possible pour permettre le dosage des toxines urémiques. La mise à mise sera réalisée sans réveil par dislocation cervicale.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Dans de précédentes études, la mortalité chirurgicale était de moins de 5%. La mortalité est généralement liée à l’induction d’une maladie rénale chronique trop sévère et arrive généralement dans les 24-48h après la 2° chirurgie. De plus, il n’a pas été noté de comportements anormaux dénotant une souffrance ou une anxiété des animaux. Il n’a pas été noté de perte d’appétit en condition de régime pauvre en protéine dans nos précédentes études. L’appétence pour les probiotiques est bonne. L’utilisation de régimes pauvre en protéines peut cependant induire une agressivité chez les animaux. Au cours de cette étude l’administration du probiotique se fera en intrabuccale grâce à l’utilisation d’une simple pipette et d’un cône. Par ailleurs les souris seront amenées à subir des test métaboliques nécessitant un prélèvement d’un micro-goutte de sang par incision de la portion terminale de la queue. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin de la procédure, toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale selon le protocole soit animaux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La production des déchets urémiques résulte à la fois de la diminution du fonctionnement du rein et de la composition modifiée du microbiote. Ces éléments ne sont pas modélisables sur un modèle cellulaire. De plus nous voulons étudier en autre les modifications de la structure l’intestin et de la régulation de la glycémie qui nécessite des examens trop invasifs pour être réalisé chez l’homme. Enfin l’étude de l’impact du probiotique sur la croissance dans une population d’enfant ayant une maladie rénale n’est pas possible à ce stade de développement du fait du risque potentiel infectieux de ce traitement. Ainsi toute expérimentation dans des modèles cellulaire ou chez l’homme est impossible à ce stade.
2. Réduction
Nous avons pris les dispositions nécessaires pour éviter le double emploi de notre procédure expérimentale. En effet, à notre connaissance, la question scientifique que nous posons ici n’a encore jamais été adressée. Il s’agit donc d’un projet totalement original et nous avons veillé, lors de l’élaboration de notre procédure, à éviter toute redondance dans les expérimentations. Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Le nombre de souris du groupe contrôle a été réduit au minimum car des données obtenues d’expérience précédente seront réutilisées. Nous utiliserons au maximum 260 souris.
3. Raffinement
Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. Des antidouleurs seront délivrés systématiquement au moment de la chirurgie et 48 après. Les interventions seront réalisées sur tapis chauffant. Une surveillance 2 fois par jour sera effectuée pendant les 48 premières heures après les chirurgies. Dans les suites, les souris seront surveillées 1 fois par jour 5 jours par semaine afin de repérer toutes situation d’inconfort, de stress, douleurs ou agressivité. Pour limiter l’anxiété, les animaux seront placés 5 par cage. L’agressivité sera en particulier évaluée chez les animaux sous régimes pauvre en protéines. Tout au long de notre expérimentation nous resterons également vigilants à la survenue des points limites. Si une atteinte des points limites définis est constatée, les animaux seront sortis du protocole et mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale. Les prélèvements réalisés sur souris vigiles seront réalisés par incision de l’extrémité de la queue préalablement anesthésiée par crème anesthésiante locale. Au cours des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, en cas de glycémie trop haute ou trop basse à la fin du test, cela constitue un point limite et les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale L’administration des probiotiques sera réalisée directement dans la bouche par le même opérateur durant toute la procédure pour éviter tout traumatisme des animaux. Nous évitons ainsi le gavage directement dans l’estomac qui pourrait causer des lésions internes.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le présent protocole sera conduit sur des souris, car le modèle de maladie rénale chronique, est facilement réalisable et permet l’induction d’une maladie rénale chronique de stade modéré. De plus, l’altération de la fonction rénale chez la souris reproduit les modifications systémiques que l’on peut observer chez l’homme (accumulation de toxines urémiques, hyperglycémie, modification du microbiote intestinale). Des souris âgées de 4 semaines ont été choisi car les souris sont dans une phase de croissance et d’étudier plus spécifiquement l’intérêt de ce probiotique sur la croissance. Des souris âgées de 12 mois seront utilisées afin d’évaluer l’impact du probiotique sur la dénutrition en particulier, reproduisant une situation retrouvée chez l’homme adulte.