Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-10-23 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-798936)
2 719 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 134 d’entre elles et modéré pour 1 585. Sur les 2 014 souris génotypées par biopsie de la queue, seules 880 portent le génotype recherché et reçoivent trois injections dans l’abdomen à 24 heures d’intervalle. 1 045 souris reçoivent une injection dans le globe oculaire sous anesthésie générale, répétée 48 heures plus tard pour 760 d’entre elles, et 705 autres reçoivent une molécule dans leur eau de boisson pendant trois à cinq jours. Les souris au génotype recherché sont tuées pour analyser leurs deux rétines, les mâles sans ce génotype sont tués aussi, les femelles sans ce génotype étant gardées pour la reproduction.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La rétine des mammifères n’a pas de capacité d’auto-réparation en cas de maladie neurodégénérative. Toutefois, certaines cellules de la rétine (dîtes « cellules de Müller ») ont gardé un certain degré de capacité régénérative que l’on peut stimuler grâce par exemple à l’ajout de facteurs de croissance. Ainsi traitées, elles sont capables d’effectuer les premières étapes de la régénération, et dans une faible mesure elles donnent ensuite naissance à quelques nouveaux neurones (neurogenèse). Afin d’étudier les processus de régénération, nous utilisons des explants de rétines de souris cultivés ex vivo. Nous pouvons ainsi facilement étudier le comportement des cellules de Müller dans différentes conditions expérimentales. Nous avons remarqué lors de la culture de tels explants rétiniens que les cellules de Müller n’ont pas toutes la même capacité à proliférer selon leur localisation dans la rétine. Notre objectif est d’une part de déterminer si cette répartition spatiale est également vérifiée in vivo et d’autre part de caractériser les mécanismes qui sous-tendent ces différences de capacité proliférative. In fine, ce projet devrait nous permettre de découvrir chez la souris des facteurs qui pourraient réveiller les propriétés régénératives de la rétine.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
A court terme, ce projet devrait permettre de mieux comprendre pourquoi les mammifères sont dépourvus de capacité régénérative rétinienne efficace. Les expériences mises en œuvre ont pour but d’évaluer in vivo l’efficacité de facteurs favorisant la prolifération et la neurogenèse de la rétine de souris. La perte de vision chez l’homme est un problème de santé publique majeur. Ainsi, à long terme, nous espérons que ce projet contribuera au développement de stratégies thérapeutiques régénératives qui n’existent pas à l’heure actuelle.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
– Génotypage et identification : 2014 animaux (dont seuls 880 animaux ayant le génotype d’intérêt seront alors injectés en intrapéritonéal). – Injection intrapéritonéale : 880 animaux (3 injections à 24h d’intervalle). – Injection intravitréenne (dans les deux yeux, 4 minutes au total, sous anesthésie générale) pour 1045 animaux dont 760 auront la procédure répétées 48h après. – Ajout d’une molécule dans l’eau de boisson des animaux : 705 animaux.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
– L’injection intrapéritonéale permettra d’induire l’expression d’une molécule fluorescente spécifiquement dans les cellules de Müller ou dans les microglies. La molécule que l’on utilise peut entraîner une perte de poids. – L’injection intravitréenne est un acte de chirurgie légère couramment utilisé en ophtalmologie, réalisé chez l’homme sous anesthésie locale, et sans traitement post- ou pré- opératoire anti-douleur ou anti-inflammatoire. Les risques de l’injection intravitréenne sont la déshydratation et l’infection oculaire. – L’ajout d’une molécule à l’eau de boisson des souris : Cette procédure sera mise en œuvre de façon chronique pendant 3 ou 5 jours lors des expériences visant à étudier la prolifération des cellules de Müller. Les effets secondaires possibles quand la durée de l’expérience excède une semaine (ce qui n’est pas notre cas) sont une leucopénie, une anémie, et des effets possibles sur la muqueuse gastrointestinale qui peuvent se manifester sous la forme de diarrhées.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux ayant le bon génotype seront euthanasiés à la fin des procédures pour permettre les analyses sur les deux rétines des souris. Les mâles ne présentant pas le bon génotype seront euthanasiés. Les femelles ne présentant pas le bon génotype seront gardées et utilisées pour les accouplements.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel qui sera transmis au cerveau par l’intermédiaire du nerf optique. Dans ce contexte on ne peut pas se passer de l’utilisation d’animaux car les mécanismes de mort cellulaire ou de régénération sont influencés par le micro-environnement (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…) qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information.
2. Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. Nous avons réalisé un test de puissance afin de déterminer la taille de l’échantillon. Ainsi calculé, le nombre de souris par lot est de 5 souris. Nous utiliserons systématiquement les deux yeux de l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.
3. Raffinement
– L’identification par tatouage digital est une méthode qui cause peu de perturbations chez l’animal quel que soit l’âge. La biopsie caudale est prélevée juste après le tatouage. En dessous de l’âge de 10 jours, la queue est moins ossifiée que chez un animal plus âgé, la biopsie caudale peut donc être plus courte que chez un animal plus âgé, entraînant une moindre réaction. – Injection intrapéritonéale : afin de prévenir la perte de poids transitoire liée à l’injection intrapéritonéale, nous mettrons à disposition dans la cage un booster qui se présente sous la forme d’un gel contenant des nutriments à haute valeur calorique et appétant. Cela permettra d’enrichir le lait maternel à destination des petits non sevrés injectés, et ce jusqu’à leur sevrage. Après sevrage des croquettes enrichies mouillées seront mises à disposition dans la cage et ce jusqu’à l’âge de 30 jours. – Injection intravitréenne : avant l’injection intravitréenne, en plus de l’anesthésie générale, une anesthésie locale oculaire sera réalisée, puis une goutte de gel hydratant sera déposée sur l’œil. Après l’injection, une goutte de gel hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée et empêcher l’apparition de cataracte. Après l’injection intravitréenne, les souris seront déposées dans une cage de réveil posée sur un tapis chauffant afin d’éviter l’hypothermie. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil puis quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérience. Une grille d’évaluation de la douleur est utilisée pour apprécier l’état des animaux. Si des signes de mal être ou de gêne se manifestent, ou en cas de perte d’appétit ou de prostration, les animaux seront soit soignés soit euthanasiés selon les critères de la grille établie. – Modification de l’eau de boisson : pour éviter l’aversion des souris envers l’eau de boisson modifiée, celle-ci sera supplémentée avec du glucose pendant les 3 ou 5 jours selon la procédure.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l’ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Nous utiliserons des souris âgées de 15 jours à 35 jours correspondant respectivement à un stade « adolescent » et « adulte ». En effet, les analyses réalisées précédemment au laboratoire dans d’autres projets ont toutes été réalisées dans cette fourchette de temps. Par ailleurs, dans le cas des procédures nécessitant l’injection intrapéritonéale, nous devons réaliser l’injection sur des souris de 15 jours pour laisser le temps nécessaire à l’expression de la molécule fluorescente (environ 15 jours sont nécessaires).