Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/05/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-833321)
Des tests de mesure de la douleur toutes les trente minutes pendant cinq heures, puis une fois par jour pendant cinq jours : 800 rats vont être utilisés, 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 200 opérés sous anesthésie profonde et tués avant tout réveil. Le protocole prévoit une injection directement dans le liquide céphalo-rachidien au niveau du tronc cérébral ou dans un ganglion nerveux, puis pour une partie des animaux une trachéotomie, une canulation de la carotide et de la jugulaire, une craniotomie et l’exposition de la zone d’enregistrement. Le porteur attend le développement d’une hypersensibilité douloureuse et décrit les mesures de sensibilité cutanée comme peu douloureuses, l’animal pouvant se soustraire au stimulus. Il retient le rat Sprague-Dawley parce que son système nociceptif est comparable à celui des humains, autrement dit parce que l’espèce ressent la douleur qu’on lui inflige de façon proche de la nôtre.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui apparaissent suite à une inflammation du système nerveux. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans la génèse de l’allodynie en condition inflammatoire sont peu connus. Des résultats préliminaires ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité cellulaire et une dérégulation de canaux cellulaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation du canal reste toujours en suspend. Récemment, une étude a montré l’implication d’un nouvel inhibiteur dans l’inhibition spécifique des canaux. Ce projet aura donc pour objectif de tester, dans notre modèle animal, si cet inhibiteur agit sur la dérégulation des canaux par des approches comportementales, moléculaires, immunohistochimiques et électrophysiologiques in vivo. Ce projet sera réalisé sur des rats adultes mâles et femelles.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation du canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 3 :•Prélèvements des cellules vaginales (1 fois par jour de test ou d’injection,
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Afin de diminuer le stress lié aux tests de comportement et aux injections, les animaux ont une période d’adaptation suite à la livraison, suivie d’une période d’habituation pour le comportement. Les mesures de sensibilité cutanée sont peu douloureuses, puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil, avec possibilité d’échappement et n’entrainent pas de réactions visibles, autre que le retrait moteur de la zone stimulée. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin des procédures , les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d’intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique, protéique ou électrophysiologique.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique.
2. Réduction
Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales. Le nombre de 8 rats /groupe pour les études est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux maximum par groupe: habituation, injections ,comportement, prélèvements des tissus. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 8 animaux sont suffisants, nous n’utiliserons pas plus d’animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d’animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d’animaux, les études électrophysiologiques in vivo et comportementales seront réalisées dans un premier temps et si nous n’obtenons pas de résultats significatifs les autres procédures ne seront pas réalisées.
3. Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d’atteindre un poids supérieurs à 300g. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée de 5 jours après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences en comportement( Jour 1: habituation à l’expérimentateur et la box de comportement/ Jour 2: habituation à l’approche du filament de vF/ Jour 3: habituation à l’appui d’un filament de vF de faible calibre/ Jour 4 et 5: habituation et seuil de base) . Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré régulièrement jusqu’à la fin de l’expérimentation. La nourriture sera humidifiée pour faciliter son absorption. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). Si, suite l’évaluation avec la grille de scores, l’état général de l’animal décroît, alors il sera mis à mort. Les tests électrophysiologiques seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane, avec un mélange d’oxygène et de protoxyde d’azote, et sans réveil.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souche de rat Sprague-Dawley est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux âgés de 5 à 8 semaines (125g à 300g). Les différentes études sur la douleur sont réalisées sur des animaux adultes. Les différents types de douleur trigéminale est majoritaire chez les personnes adultes. L’utilisation de rats dans les études comportementales sur la douleur est largement répandue et justifiée par plusieurs facteurs scientifiques et éthiques. Les rats partagent des similitudes biologiques et physiopathologiques avec les humains, en particulier dans le système nerveux et la réponse à la douleur. Leur système nociceptif (responsable de la détection de la douleur) est comparable à celui des humains, ce qui permet d’étudier des mécanismes de la douleur qui peuvent être extrapolés à l’homme.