Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-869296)
60 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère selon les groupes. Elles subissent un jeûne de 24 heures, un régime gras ou une injection de lipopolysaccharide induisant une anorexie inflammatoire, avant d’être décapitées sous anesthésie pour prélever le tronc cérébral, afin d’étudier le rôle de la connexine Cx43 dans la balance énergétique. Le porteur indique que le jeûne provoque une perte de poids allant jusqu’à 15% et que le produit inflammatoire entraîne anorexie, hyperalgésie et évitement social. Il conclut à l’absence de « méthode de substitution » pour étudier ces mécanismes.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’obésité et l’anorexie induite par la maladie sont des problèmes de santé publique majeurs caractérisés par une rupture de la balance énergétique (équilibre entre les dépenses énergétiques de l’organisme et les apports par la prise alimentaire). Le complexe vagal dorsal (CVD) et l’hypothalamus médiobasal sont des régions cérébrales clés du contrôle de cette balance. Ils contiennent des réseaux de neurones sensibles à de multiples signaux informant du niveau des réserves énergétiques de l’organisme. Ces neurones interagissent avec les cellules gliales qui sont indispensables à l’activité neuronale dans de nombreux processus métaboliques et cognitifs. La façon dont les cellules gliales contribuent au contrôle de la balance énergétique reste cependant à explorer. Ce projet cherche à tester si les cellules gliales du CVD et de l’hypothalamus médiobasal sont capables de moduler leur communication lors de modifications du statut métabolique et d’informer les neurones impliqués dans le maintien du poids corporel. Dans ce contexte, nous focalisons notre attention sur le rôle d’une protéine, la connexine (Cx43), grâce à laquelle les cellules gliales communiquent entre elles et émettent des substances neuroactives. La Cx43 permet de constituer des hémicanaux s’ouvrant sur le milieu extracellulaire par lesquels les cellules gliales peuvent émettre des substances neuroactives. L’objectif du projet est d’évaluer comment les hémicanaux constitués de Cx43 (Cx43HC) sont affectés par le statut nutritionnel et le statut métabolique des animaux. Nous faisons l’hypothèse que des molécules libérées par les Cx43HC pourraient participer à la régulation de la balance énergétique et que l’ouverture des hémicanaux pourrait être modifié selon le métabolisme énergétique ou le statut nutritionnel pour réguler le passage de telles molécules. Pour tester notre hypothèse, nous souhaitons réaliser des expériences in situ sur des tranches aigües de tronc cérébral et d’hypothalamus et des analyses biochimiques pour mettre en évidence des modifications de la perméabilité des Cx43HC. Les résultats attendus de ce projet devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes de rupture de la balance énergétique tout en identifiant des cibles potentielles d’intérêt thérapeutiques pour lutter contre l’obésité ou l’anorexie induite par l’inflammation.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Pour comprendre comment les hémicanaux constitués de Cx43 (Cx43HC) sont affectés par le statut nutritionnel ou une modification du métabolisme énergétique, nous évaluerons l’activité des hémicanaux constitués de Cx43 (Cx43HC) dans un modèle in situ de tranches hypothalamiques et de tronc cérébral. Ce modèle nous permet de déterminer le degré d’ouverture des HC lors d’un défi énergétique (jeûne, anorexie induite par l’inflammation, régime obésogène court). Cette approche sera complétée par des analyses biochimiques qui permettront d’identifier des modifications post-traductionnelles associées à une variation de la perméabilité des Cx43HC dans les mêmes conditions de rupture de la balance énergétique. Pour ce projet, nous testerons les effets de 3 conditions connues pour affecter le statut nutritionnel et métabolique des animaux : -un jeûne de 24h (procédure 1), -un régime enrichi en graisse de 3 jours (procédure 2), -une anorexie inflammatoire induite par le lipopolysaccharide (LPS ; injection ip unique ; 0,4 mg/kg à 0.1 mL/10g de poids corporel, 1h30 avant la mise à mort, procédure 3). Les souris concernées seront ensuite anesthésiées et après vérification de l’atteinte d’un pallier chirurgical d’anesthésie par l’absence de réflexe au pincement de la patte, les souris seront mises à mort par décapitation. Cette méthode de mise à mort est la seule qui préserve intacte la structure du bulbe rachidien étudiée. Leurs cerveaux seront extraits en vue : 1/ de tester l’activité hémicanal sur un modèle de tranches aigües de tronc cérébral et d’hypothalamus. 2/ d’analyser les modifications post-traductionnelles associées aux modifications du statut énergétique et témoignant d’une modification de la perméabilité des Cx43HC.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour comprendre comment les hémicanaux constitués de Cx43 (Cx43HC) sont affectés par le statut nutritionnel, nous évaluerons l’activité des hémicanaux constitués de Cx43 (Cx43HC) dans un modèle in situ de tranches hypothalamiques et de tronc cérébral. Ce modèle nous permet de déterminer le degré d’ouverture des HC lors d’un défi énergétique (jeûne, anorexie induite par l’inflammation, régime obésogène court). Cette approche sera complétée par des analyses de biologie moléculaire qui permettront d’identifier des modifications post-traductionnelles associées à la perméabilité des Cx43HC lors de modification du statut nutritionnel. Ce projet nécessite l’utilisation de 60 souris mâles. Pour ce projet, nous testerons les effets de 3 conditions connues pour affecter le statut nutritionnel : un jeûne (durée 24h), un régime alimentaire enrichi en graisse (durée 72h) et une anorexie inflammatoire induite par injection aigue de lipopolysaccharide (durée 1h30). Les souris concernées seront ensuite anesthésiées (Kétamine/Xylazine 120 mg/kg et 16 mg/kg respectivement ; ip 0,1 ml/10g) et leurs cerveaux seront extraits en vue : 1/ de tester l’activité hémicanal sur un modèle de tranches aigues de tronc cérébral et d’hypothalamus. -12 animaux seront mis à jeun pendant 24h (n=12) -12 animaux seront soumis à 3 jours de régime alimentaire enrichi en graisse (n=12) -12 animaux seront exposées à l’anorexie inflammatoire consécutive à une injection de Lipopolysaccharide (0,4 mg/kg ; ip 0,1 ml/10g) pendant 1h30 (n=12) 2/ d’analyser les modifications post-traductionnelles associées aux modifications du statut énergétique et témoignant d’une modification de la perméabilité des Cx43HC. Pour ces analyses, 8 animaux sont nécessaires par groupe (3×8 = 24, soumis aux différents régimes). Ainsi, 20 animaux seront soumis à un jeûne, 20 animaux seront soumis à un régime enrichi en graisse et 20 animaux feront l’objet de la procédure induisant une anorexie inflammatoire.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les procédures utilisées ont pour objectif de tester l’impact du statut nutritionnel sur l’activité hémicanal dans un modèle in situ. L’accomplissement de cet objectif implique des modifications contraignantes du statut énergétique des animaux. -Le régime enrichi en graisse est connu pour ne générer aucune douleur, souffrance ou angoisse chez la souris et nous n’attendons pas de nuisance associée au régime. -Le jeûne de 24h est une source de stress pour l’animal, entrainant une perte de poids corporel importante chez les animaux représentant jusqu’à 15% du poids corporel ainsi que des modifications du statut métabolique (shift vers une oxydation lipidique au détriment de l’oxydation glucidique). -L’injection aigue de lipopolysaccharide est classiquement utilisée pour induire une anorexie inflammatoire chez les animaux. Ce traitement engendre un état de maladie transitoire des animaux, dont les symptômes (anorexie, hyper ou hypothermie, hyperalgésie, inactivité, somnolence, évitement social et libération d’hormone de stress) culminent à 6-10h post injection et se résolvent en 24h. Ces symptômes restent limités pour la durée d’exposition sélectionnée pour ce projet (1h30). La contention avant les injections intrapéritonéale et retrouvée dans toutes les procédures est une source de stress pour l’animal. Les souris seront mises à mort, par décapitation sous anesthésie générale profonde au moment correspondant à la fin du la durée d’exposition prévue pour chaque procédure (après 3 jours d’exposition au régime enrichi en graisses ; après 24h de jeûne ; 1h30 après l’injection de LPS).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les souris seront mises à mort par décapitation sous anesthésie générale profonde pour des analyses physiologiques post-mortem.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de la consommation alimentaire du poids corporel ou permettant d’étudier l’activité hémicanal.
2. Réduction
Notre expertise nous permet de définir au plus juste le nombre d’animaux nécessaire aux mesures post-mortem terminales après 3 procédures de modification du statut nutritionnel (24h de mise à jeun ; exposition durant 1h30 à l’anorexie inflammatoire induite par une injection de LPS ; ou après 3 jours d’un régime alimentaire enrichi en lipides). -Pour chaque expérience in situ utilisant des tranches aigues d’hypothalamus et de tronc cérébral, 12 animaux sont nécessaires à l’obtention d’une puissance statistique suffisante. Ce nombre d’animaux a été déterminé à partir de précédentes études réalisées sur des tranches d’animaux naïfs (mise à mort réglementaire). Le complexe vagal dorsal du tronc cérébral est une petite structure qui limite le nombre de tranches disponibles (environ 3 tranches par animal). La mesure du taux d’ouverture des hémicanaux Cx43 nécessite de comparer des tranches incubées dans trois solutions différentes (condition sans agent pharmacologique : aCSF), avec un large bloqueur des hémicanaux (contrôle négatif), et avec un agent pharmacologique spécifique des hémicanaux de connexine 43. Au moins 2 tranches par condition sont nécessaires. Il faut donc 2 animaux par expérience. Pour obtenir la puissance statistique appropriée, 6 expériences indépendantes sont nécessaires.12 animaux par procédure in situ seront donc utilisés. -Pour les analyses biochimiques (niveaux protéiques et modifications post-traductionnelles), 8 animaux par groupe sont nécessaires à l’obtention d’une puissance statistique suffisante. Ce nombre d’animaux a été déterminé à partir de précédentes études d’analyses de niveaux protéiques, des méthodes utilisées en routine au sein de notre équipe de recherche. Au total ce projet prévoit l’utilisation de 60 animaux, dont 36 animaux pour les analyses in situ et 24 animaux pour les analyses biochimiques.
3. Raffinement
Toutes les procédures mentionnées dans ce projet sont réalisées en routine au laboratoire. Les animaux utilisés seront commandés au minimum un semaine avant le début de la procédure pour permettre une période d’acclimatation à l’animalerie. L’hébergement des animaux se fait avec un enrichissement du milieu, dans un environnement à température et hygrométrie contrôlées et un cycle jour/nuit 12h/12h. Les animaux font l’objet d’un suivi quotidien, avec la mise en œuvre d’actions adaptées lors d’éventuels franchissement des points limites ou points d’arrêt. Un animal montrant des signes de souffrance avant le début d’une procédure recevra un traitement analgésique morphinique et n’intègrera la procédure qu’après retour à un état normal. Cette précaution évite toute amplification des nuisances liées à la procédure en raison d’un problème intercurrent. A la fin des procédures la mise à mort par décapitation est réalisée sous anesthésie générale pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Toutes les procédures mentionnées dans ce projet ont déjà été mises au point chez la souris dans notre équipe. Les animaux utilisés seront de jeunes souris adultes (7 semaines d’âge) au démarrage de l’expérimentation. Le choix de ce stade de développement est guidé par la volonté de réaliser des expériences chez la souris adulte et parce que le modèle in situ est optimisé pour des souris de 7 semaines. Ce stade de développement est classiquement choisi pour les expériences in situ chez les animaux considérés adultes.