Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/06/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-876022)
Anesthésiées à dose létale puis perfusées avec un fixateur pendant une dizaine de minutes, 120 souris mâles sont tuées sans reprendre conscience. Quatre y passent chaque jour pendant quinze jours, sur deux lignées mutantes, pour que leurs testicules soient prélevés à des stades précis de la production de spermatozoïdes. Le travail compare l’expression des gènes entre ces mutants et des souris normales déjà utilisées dans un autre projet, avec en perspective l’infertilité masculine et une contraception masculine non chirurgicale. Le porteur affirme que seule une approche impliquant des animaux permet de répondre à ces questions et que le remplacement par des lignées cellulaires est impossible.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La spermatogenèse est le processus par lequel les spermatozoïdes sont produits à partir des spermatogonies (cellules souches des spermatozoides), des cellules souches situées dans les testicules. Ce processus se déroule dans de petits tubes appelés tubes séminifères, à l’intérieur des testicules. Chez la souris, un cycle complet de spermatogenèse dure 35 jours et comprend 12 étapes successives. Dans un testicule normal de souris sauvage, ces étapes se répètent de manière aléatoire tous les 8 jours environ, ce qui permet aux 12 étapes d’être présentes simultanément dans le testicule. Dans le cadre de ce projet, nous travaillons sur des souris mutantes où la spermatogenèse est naturellement synchronisée. Cela signifie que, contrairement aux souris sauvages, seules 1 à 3 étapes du cycle sont présentes simultanément dans les testicules, sans avoir recours à des interventions chimiques. Nous utilisons deux lignées mutantes provenant d’un fond génétique mixte. La première lignée présente des cellules de Sertoli qui ont perdu leur récepteur de l’acide rétinoïque alpha (RARA). La seconde lignée a été modifiée par mutagenèse pour altérer un site de fixation sur RARA, empêchant ainsi son interaction avec les protéines qui permettent d’empecher la répression des gènes. Les testicules de ces mutants seront utilisés pour analyser l’expression des gènes à chaque étape du cycle de la spermatogenèse, en lien avec les mécanismes régulés par l’acide rétinoïque.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Dans la mesure où la spermatogenèse suit des mécanismes conservés entre la souris et l’Homme, les découvertes réalisées dans ce projet sont pertinentes pour la compréhension de la fertilité humaine. En comparant les profils d’expression génique des souris mutants avec ceux des souris de type sauvage dont nous disposons déjà dans un autre projet réalisé ultérieurement, nous pourrons identifier les gènes essentiels à la différenciation des cellules germinales. Ces résultats fourniront des pistes pour mieux comprendre certaines causes d’infertilité masculine, en augmentation constante dans le monde. De plus, l’étude des mécanismes régissant la signalisation de l’acide rétinoïque pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de contraception masculine non chirurgicale. Mais aussi, l’acide rétinoïque, régulateur clé de la différenciation cellulaire et de l’expression génique, joue un rôle essentiel dans la spermatogenèse, la folliculogenèse et le maintien de la fertilité. Comprendre sa voie de signalisation pourrait offrir de nouvelles perspectives face à la baisse de la fertilité et de la fécondité observées aujourd’hui.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Trente minutes avant l’anesthésie, une injection d’analgésique est administrée (en quelques secondes) pour prendre en charge la douleur. Ensuite, une anesthésie et analgésie à dose létale sont réalisées (en quelques secondes) en vue de la perfusion d’un fixateur histologique lors de l’étape finale de la mise à mort. Cette procédure est effectuée sur des souris âgées de 10 à 12 semaines. Les souris sont placées sous anesthésie générale profonde en moins de cinq minutes. La perfusion, qui dure environ dix minutes, conduit à la mort de l’animal.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux utilisés dans cette étude ne présentent aucun phénotype dommageable lié à leur génotype, et leur développement est normal. La procédure est réalisée sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de garantir l’absence de douleur ou de souffrance. L’anesthésie peut induire un stress et une hypothermie. Les contentions et injections, peuvent entraîner une gêne passagère chez l’animal, cependant des mesures d’analgésie et d’anesthésie sont systématiquement mises en place pour assurer le confort et l’absence de douleur ou de conscience pendant la procédure.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d’organes.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La spermatogenèse est un processus complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires du testicule. Les interactions entre les cellules qui soutiennent la fonction des testicules et celles qui produisent les spermatozoïdes sont essentielles pour garantir une production continue de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le profil d’expression des gènes impliqués dans la spermatogenèse dans un contexte physiologique où ces interactions cellulaires sont dérégulées chez des mutants. Il est important de souligner que seule une approche expérimentale impliquant des animaux permet de répondre à ces questions. Le remplacement par des lignées cellulaires (1er R de la règle des 3R) est impossible.
2. Réduction
Dans ce projet, nous utilisons uniquement des souris mâles, car nous étudions la production de spermatozoïdes, appelée spermatogenèse. Ce processus dure 35 jours et se divise en 12 étapes successives. Chez les souris normales, ces étapes coexistent en même temps dans les testicules. Mais chez les souris mutants, seuls 3 à 4 stades sont présents simultanément. Pour analyser toutes les étapes, nous réalisons des prélèvements quotidiens pendant 15 jours, entre les jours 70 et 84 après la naissance. Chaque jour, 4 souris sont utilisées pour garantir la fiabilité des résultats, en prenant en compte les pertes naturelles possibles (comme l’abandon maternel ou le cannibalisme). En tout, nous utilisons 60 souris par lignée, pour un total de 120 souris, le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique. Cependant, dès que nous obtenons 3 souris montrant les stades nécessaires, le projet est arrêté pour éviter l’utilisation excessive d’animaux.
3. Raffinement
Toutes les mesures requises sont mises en place pour assurer le bien-être des animaux. Les mâles sont gardés en groupe de mâles familiers et stables. Un nid de coton ou un nid végétal est ajouté dans chaque cage pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal, comme cela est fait dans toutes les cages. Nous surveillons régulièrement le bien-être et l’état de santé des animaux et nous apportons des soins appropriés en cas de besoin, notamment l’administration d’analgésiques qui se fera en cas d’observation de signes de douleur. Toute modification de leur comportement indiquant une souffrance ou de l’anxiété est immédiatement signalée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) afin de prendre les mesures correctives nécessaires. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie et la douleur est prise en charge par l’administration d’analgésiques. De plus, des points limites adaptés sont définis pour chaque animal, de manière à assurer qu’aucune souffrance prolongée ne soit tolérée et que des interventions soient effectuées avant que ces seuils ne soient atteints. Ces points limites servent de guide pour l’arrêt de l’expérience ou la prise en charge d’une situation d’urgence.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Notre étude cherche à comprendre comment certains gènes fonctionnent mal dans un modèle de souris mutante pendant la production des spermatozoïdes. Nous nous intéressons particulièrement aux interactions entre les différentes cellules des testicules et à l’impact de certaines molécules sur ce processus dans tout l’organisme. Les souris sont choisies pour cette étude car elles partagent 99 % de leur ADN avec l’Homme, et les mécanismes cellulaires dans les testicules de souris sont similaires à ceux des humains. Nous prélevons les testicules des souris mâles entre 70 et 84 jours après leur naissance. Cela permet d’observer les étapes de la production des spermatozoïdes de manière précise, car prélever plus tôt ne permettrait pas de voir un développement testiculaire suffisant, et attendre plus longtemps pourrait entraîner un blocage de la production. Un cycle complet de production des spermatozoïdes dure environ 35 jours et se divise en 12 étapes. Pendant les 15 jours de notre étude, deux nouvelles vagues de production de spermatozoïdes commencent, mais cela ne correspond pas à deux cycles complets. Chez les souris mutantes, plutôt que d’avoir les 12 étapes présentes en même temps comme chez les souris normales, seules 3 à 4 étapes apparaissent à la fois. En prélevant les souris mutantes chaque jour pendant ces 15 jours, nous pouvons couvrir toutes les étapes du cycle de la production de spermatozoïdes.