Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 18/03/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-893215)
Réparties en 25 lots de 10 pour autant de conditions expérimentales, 250 souris vont être utilisées, 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 50 dans des procédures légères, toutes tuées puis autopsiées. Les expérimentateurs instillent des virus grippaux dans chaque narine sous anesthésie, la veille ayant déjà donné lieu à une injection dans l’abdomen, avec des traitements qui renforcent ou affaiblissent leurs défenses antivirales. Le projet vise à démontrer expérimentalement une hypothèse déjà suggérée par des travaux antérieurs, l’élimination des variants viraux par l’immunité innée. Le porteur admet que l’infection peut aller jusqu’à la mort de l’animal, et retient comme points d’arrêt une perte de poids supérieure à 25 %, des difficultés respiratoires, la léthargie, la prostration ou la déshydratation.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Lors d’une infection par un virus de la grippe et suite à la réplication dans l’hôte, de très nombreux virus ayant des codages génétiques différents peuvent apparaitre. Ces virus peuvent ainsi acquérir des avantages sélectifs positifs ou négatifs par rapport aux autres. Par exemple, la capacité à se multiplier plus ou moins vite ou à échapper aux anticorps, etc. Ainsi peuvent émerger des virus de plus en plus résistants (qui vont persister) ou au contraire moins résistants (qui vont disparaitre). Des travaux menés sur les virus influenza aviaires et humains ont suggéré que les défenses de l’hôte (sa réponse immunitaire innée) était capable de prévenir l’émergence de variants, d’autant plus s’ils étaient minoritaires. Autrement dit, si un variant apparaît, il peut être éliminé par les défenses immunitaires avant d’avoir eu l’opportunité de se multiplier, même s’il était très avantagé par rapport aux autres virus. Pourtant, ceci n’a jamais été formellement démontré expérimentalement. Grâce à ce projet nous souhaitons donc vérifier cette hypothèse chez la souris. Pour cela, nous allons utiliser un couple de virus : un virus H1N1- muté se multipliant difficilement dans les cellules et un virus H1N1+ normal se répliquant facilement (du fait de son avantage sélectif). En infectant les animaux avec une grande quantité de virus se multipliant difficilement H1N1- et une petite quantité virus pouvant se répliquer facilement H1N1+, nous souhaitons démontrer qu’un virus avec un avantage sélectif va prendre le dessus même s’il est en plus faible quantité sur le virus sans avantage ayant initialement causé l’infection, si les défenses immunitaires sont amoindries. Nous prouverons ainsi que l’apparition de ce nouveau virus H1N1+ (issu de celui initialement ayant causé l’infection H1N1-) n’est possible qu’en cas de système immunitaire défectueux. Pour moduler l’efficacité des défenses immunitaires, nous utiliserons des molécules favorisant l’activité antivirale (interféron alpha) ou au contraire des molécules freinant cette activité (des molécules qui empêchent les interférons naturellement produits par l’hôte d’être efficace). Ces molécules seront donc prises en compte dans notre projet pour décrire l’émergence d’un virus. Au total 25 lots d’animaux (10 souris par lot) participeront à 25 Conditions Expérimentales (CE) différentes. A la fin de chaque condition, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements seront effectués afin de prouver les hypothèses avancées.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Mieux comprendre l’émergence des virus influenza dans les espèces et les modulations favorables ou défavorables par des prétraitements immunitaires (interferon alpha et anticorps aux récepteurs des interferons) permettra à la communauté scientifique d’avancer sur la lutte contre les virus influenza chez l’homme et l’animal. Cette preuve de concept pourra aussi servir de base en recherche vis-à-vis de l’émergence d’autres virus.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Tous les animaux seront traités avec des molécules immunitaires activatrices ou inhibitrices de l’activité antivirale (interferon alpha et anticorps aux récepteurs des interferons) ou avec du sérum physiologique (NaCl 0.9%). Un jour avant l’infection, une injection intrapéritonéale de volume 0.2 mL sera pratiquée avec une aiguille ultra fine (durée 1s) Pour les animaux infectés afin d’éviter toute nuisance ou sensation désagréable pendant l’instillation intranasale une anesthésie sera réalisée avant l’acte. L’instillation du ou des virus sera ensuite effectuée dans chaque narine. 50μL seront déposés sur chaque muqueuse nasale (durée de l’instillation 20s les 2 narines).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les effets indésirables provoqués par les virus influenza injectés dans les souris pouvant aller jusqu’au décès de l’animal, des points cliniques d’arrêt de l’expérience ont été définis afin de limiter leur souffrance et, sont tracés quotidiennement sur des fiches de suivi. Les traitements permettant d’augmenter ou de diminuer les défenses immunitaires n’ont pas d’effet indésirable connu. Ainsi l’animal est sorti du projet – Si une perte de poids est supérieure à 25% par rapport à un poids moyen de référence – S’il a des difficultés respiratoires – Si son comportement est anormal léthargique, prostré ou adopte une position démontrant une souffrance (flanc creusé, couché…) – S’il se déplace difficilement – Est déshydraté – A des troubles neurologiques divers …
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Pour mieux comprendre l’émergence des virus influenza dans les espèces et les modulations favorables ou défavorables de cette émergence par des prétraitements immunitaires. A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés puis autopsiés et les prélèvements nécessaires seront effectués. Ces prélèvements permettront de définir le virus émergent génétiquement, le quantifier, et d’évaluer l’intensité de la réponse immunitaire.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il n’existe aucune méthode in vitro et ex vivo permettant d’étudier l’émergence de virus combiné à la complexité de la réponse immunitaire chez l’homme ou l’animal. Il est donc impossible pour notre projet de nous passer du modèle in vivo.
2. Réduction
Le nombre d’animaux par condition expérimentale (10) et point temps 5 (autopsie des animaux à 48h et 72h post infection) est déterminé de façon à pouvoir évaluer par des tests statistiques les différences entre les groupes d’animaux. Les différences de charges virales et des niveaux de transcrits des gènes de l’hôte seront évaluées par des tests statistiques. Pour comparer des charges virales et les niveaux de transcrits des gènes de l’hôte , des groupes de 5 sont suffisants pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives.
3. Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux et maximiser leur bien-être, les mesures suivantes sont appliquées : Les souris seront hébergées par groupes sociaux harmonieux de 5 (dans des cages pouvant accueillir 6 animaux). Des enrichissements (abris en cellulose, tunnels en plexiglass, cylindres en coton…) sont fournis pour favoriser leur comportement naturel. Les souris sont manipulées et contrôlées deux fois par jour. Cette surveillance permettra d’identifier les animaux en souffrance (le personnel remplit une grille de scoring permettant un suivi du comportement et de l’état physique) et, elle permettra aussi d’effectuer des actions en lien avec les observations (séparation des animaux, atteintes de points limites définis pour éviter toute souffrance animale…). Les gestes techniques sont réalisés sous anesthésie générale (inoculation intranasale pour l’infection et euthanasie) et les souris sont habituées aux gestes par le personnel pour diminuer le stress et toutes appréhension liées aux manipulations.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Souris C57BL/6 âgées de 4 à 6 semaines : il s’agit de la souche la plus utilisée pour les infections par les virus influenza, c‘est un excellent modèle pour évaluer la réplication et donc l’émergence virale. L’âge est bien adapté car les souris âgées de 4 à 6 semaines ont déjà un système immunitaire fonctionnel. De plus, nombreux réactifs au vu de son utilisation fréquente sont également disponibles pour moduler la réponse immunitaire, ce qui n’est pas le cas des autres modèles animaux. Le modèle rongeur permettra ensuite des extrapolations chez l’homme et d’autres espèces.