Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 05/11/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-898890)
Six souris issues de l’élevage interne sont affectées à l’apprentissage des gestes techniques par deux expérimentateurs, et quinze reproductrices sont réintégrées dans le protocole pour produire des sérums hyperimmuns. 141 souris génétiquement modifiées pour développer spontanément des plaques d’athérome vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l’issue. Injections de vaccin antigrippal et ponctions veineuses se pratiquent sur animal vigile, sans anesthésie, le porteur les jugeant peu invasives et non douloureuses. Aucun calcul d’effectif ne vient justifier le nombre de 141 souris, la rubrique consacrée à la réduction énumérant seulement les animaux mutualisés entre plusieurs usages.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Certaines maladies chroniques liées à l’âge, comme les maladies cardiovasculaires ou neurodégénératives, sont favorisées par une inflammation persistante de faible intensité, souvent silencieuse mais délétère à long terme. L’athérosclérose, épaississement progressif des parois artérielles, en est un exemple typique. Elle résulte de l’accumulation de graisses dans les vaisseaux, mais aussi — et surtout — d’une activation prolongée du système immunitaire, qui entretient une inflammation locale et systémique. Depuis quelques années, des études montrent que les personnes vaccinées contre la grippe présentent un risque réduit d’infarctus, d’accident vasculaire cérébral ou de démence. Cet effet bénéfique, observé même sans infection grippale, suggère que la vaccination pourrait exercer une protection plus large, possiblement liée à une modulation des mécanismes inflammatoires communs à plusieurs maladies du vieillissement. Le projet vise à étudier, chez la souris, l’effet de différentes formulations vaccinales contre la grippe sur l’inflammation chronique dans deux contextes : les artères (athérosclérose) et le cerveau (neuroinflammation). L’objectif est de déterminer si le vaccin peut influencer la réponse immunitaire dans ces organes et atténuer leurs conséquences pathologiques. Nous utiliserons un modèle de souris déficientes pour la protéine ApoE, connues pour développer simultanément des lésions d’athérosclérose et de neurodégénérescence, permettant d’explorer dans un même animal deux formes d’inflammation chronique. Des souris sauvage (qui constituent le fond génétique des lignées athérosclérotiques) serviront de comparaison. Les animaux recevront différentes solutions vaccinales, puis un suivi biologique sera réalisé à trois temps à partir de prélèvements sanguins. En fin de protocole, une analyse post-mortem des tissus artériels et cérébraux évaluera localement l’impact de la vaccination. Ce double niveau d’analyse, dans le sang et au niveau des tissus, est essentiel pour comprendre l’effet du vaccin dans ces contextes pathologiques. Ce projet pourrait aider à préciser le rôle de la vaccination dans la prévention de complications chroniques du vieillissement. Il repose sur l’utilisation de vaccins déjà disponibles en pratique clinique, ce qui en facilite la transposition à la médecine humaine.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à poser les bases mécanistiques nécessaires à une transposition vers la recherche clinique. Grâce à un modèle expérimental combinant deux contextes pathologiques majeurs du vieillissement (athérosclérose et neuroinflammation), il permettra de confirmer la capacité du vaccin antigrippal à moduler l’inflammation chronique de faible intensité. Notre schéma expérimental, qui intègre différentes formulations vaccinales, dont un vaccin recombinant contenant une protéine vaccinale cible, permettra d’identifier la spécificité de l’effet observé et de désigner une protéine vaccinale putative. Ces données sont indispensables pour soutenir la pertinence d’un futur essai clinique, avec constitution d’une cohorte humaine, dans le cadre d’un programme de recherche translationnelle. À terme, ce projet pourrait contribuer à un changement de paradigme : considérer certains vaccins, notamment le vaccin antigrippal, non plus seulement comme des outils de prévention infectieuse, mais comme de véritables leviers thérapeutiques pour contrôler l’inflammation liée au vieillissement et prévenir ou ralentir la progression des maladies chroniques responsables de la majeure partie de la morbi-mortalité chez les personnes âgées.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Toutes les interventions prévues dans ce projet seront réalisées sur des souris vigiles (éveillées), sans anesthésie, car elles sont considérées comme peu invasives et non douloureuses. Des souris athérosclérotiques seront dédiées à l’apprentissage des gestes techniques (injections et prélèvements) de deux expérimentateurs, sous la supervision du personnel animalier qualifié. Chaque animal sera soumis à un seul geste technique par session, d’une durée comprise entre 5 et 10 minutes, incluant la contention, la réalisation du geste et la vérification post-manipulation. Un intervalle minimal de 7 jours sera respecté entre deux gestes techniques sur un même animal. La cohorte principale de souris athérosclérotiques recevra deux injections sous-cutanées de vaccin antigrippal (à 11 et 13 semaines d’âge) d’une durée d’environ 5 minutes. Trois prélèvements sanguins (100 µL) seront réalisés par ponction veineuse — avant la première vaccination, 15 jours après le rappel et avant la fin du protocole — chacun durant environ 5 à 10 minutes. Les souris reproductrices, âgées de 6 à 7 mois, recevront trois injections vaccinales espacées de deux semaines, dans les mêmes conditions, afin de stimuler une réponse anticorps robuste.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Chez les souris déficientes de la protéine, les principales sources de gêne sont les injections et les ponctions sanguines sur animaux vigiles. Les formulations vaccinales ont déjà été administrées chez la souris et l’humain sans effets notables, hormis des réactions inflammatoires transitoires comparables à celles observées chez l’homme (érythème ou œdème localisés, 12 à 72 h). L’administration peut entrainer une gêne locale et se traduire par un grattage ou un léchage temporaire. Aucune douleur persistante ni trouble comportemental durable n’est attendu. Les prélèvements sanguins peuvent entraîner une croûte ou ecchymose légère. L’ensemble de ces interventions peuvent générer du stress pour les animaux.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
La mise à mort en fin de protocole est indispensable pour permettre une analyse fine des tissus cibles et évaluer les effets locaux de la vaccination sur la progression des atteintes pathologiques, en particulier au niveau vasculaire et cérébral. Ces analyses nécessitent le prélèvement d’organes comme l’aorte et le cerveau dans des conditions de conservation rigoureuses et dans un délai très court, incompatible avec le maintien en vie des animaux. Les examens réalisés incluront des analyses histologiques, immunohistochimiques, transcriptomiques et de cytométrie en flux, toutes essentielles pour caractériser les effets inflammatoires ou protecteurs induits par les différentes formulations vaccinales. Par ailleurs, l’analyse de la réponse humorale nécessite la récupération de volumes sanguins importants, impossibles à obtenir sur animaux vigiles sans compromettre leur bien-être. C’est dans ce contexte que les 15 souris reproductrices seront réintégrées dans le protocole pour être immunisées et mises à mort après la phase vaccinale. Elles permettront de générer des sérums riche en anticorps essentiels à l’analyses. Enfin, les 6 souris de la cohorte d’apprentissage seront nécssaire pour permettra aux expérimentateurs de s’exercer à la microdissection post-mortem en conditions réelles, après une phase préalable sur cadavres. Les tissus prélevés seront utilisés pour la mise au point des protocoles d’immunohistochimie et autres analyses exploratoires.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes de l’inflammation qui jouent un rôle central dans deux maladies liées : l’athérosclérose (responsable de nombreuses maladies cardiovasculaires) et la neuroinflammation (impliquée dans certaines maladies neurodégéneratives). Ces deux maladies interagissent entre elles. Pour les étudier, il est indispensable d’observer le fonctionnement global de l’organisme. L’utilisation de l’animal est donc nécessaire pour atteindre ces objectifs. Ce choix a été réfléchi en s’appuyant sur les enseignements de notre projet préliminaire et limité au strict nécessaire : un seul modèle animal a été retenu pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Il s’agit de la souris déficiente pour la protéine ApoE, un modèle bien connu qui développe spontanément des lésions comparables à celles de l’athérosclérose humaine, et qui présente aussi des signes d’inflammation cérébrale en vieillissant. Ce modèle permet ainsi d’étudier, dans un seul protocole, les effets de la vaccination sur ces deux maladies en interaction.
2. Réduction
Le nombre d’animaux impliqués dans ce projet a été strictement limité grâce à plusieurs mesures de réduction. Quinze souris adultes utilisées comme reproductrices (10 femelles, 5 mâles) seront réintégrées dans le protocole afin de produire des sérums hyperimmuns, évitant ainsi l’utilisation d’animaux supplémentaires pour cette finalité. Par ailleurs, six souris provenant de l’élevage interne seront dédiées à la formation des expérimentateurs aux gestes techniques (vaccination et prélèvements), dans un cadre supervisé. Une fois les expérimentateurs formés, ces animaux seront également réutilisés pour des prélèvements de tissus, permettant la mise au point des analyses post-mortem. L’emploi d’un modèle unique de souris, qui développe à la fois des lésions cardiovasculaires et une inflammation cérébrale, permet d’étudier deux pathologies systémiques au sein d’un même protocole. Ce choix limite le nombre de modèles utilisés tout en répondant aux objectifs scientifiques. Le nombre d’animaux par groupe expérimental (24 souris, soit 12 mâles et 12 femelles) a été défini à partir de calculs de puissance statistique réalisés sur la base de données issues de précédents travaux. Cette taille d’échantillon est la plus faible permettant de détecter une différence significative sur les paramètres étudiés. La répartition équilibrée par sexe permet d’explorer les effets différenciés selon le genre, sans accroître les effectifs globaux, tout en assurant la représentativité des réponses immunitaires.
3. Raffinement
Les enseignements de notre projet préliminaire ont permis de renforcer les stratégies de raffinement grâce à une familiarisation précoce, une manipulation progressive et une formation encadrée des expérimentateurs, limitant ainsi le stress, la douleur et la variabilité interindividuelle. Dès le sevrage, les souris seront manipulées deux fois par semaine afin de les habituer progressivement au contact humain et d’atténuer leur niveau de stress. La semaine précédant toute procédure invasive, des séances quotidiennes de manipulation et d’habituation spécifiques aux gestes d’injection et de prélèvement seront réalisées. Chaque manipulation sera systématiquement suivie d’une récompense alimentaire (biscuit sucré) afin de favoriser un conditionnement opérant et de renforcer l’acceptabilité des gestes. Ces stratégies visent à réduire la douleur, mais aussi à instaurer des interactions positives. Les injections seront réalisées par voie sous-cutanée entre les omoplates, une méthode choisie pour sa moindre nocivité par rapport à la voie intrapéritonéale, tout en maintenant une efficacité comparable. Les aiguilles seront systématiquement changées entre chaque animal afin de prévenir toute douleur liée à une pointe émoussée et d’éviter les contaminations croisées. Les prélèvements sanguins seront effectués par ponction sous-mandibulaire, une méthode sélectionnée pour son caractère peu invasif au regard du volume nécessaire. Chaque prélèvement sera précédé d’une pesée systématique afin de garantir le respect des seuils éthiques : le volume maximal prélevable par séance est fixé à 10 % du volume sanguin total. Le volume prévu de 100 µL par prélèvement demeure systématiquement inférieur au seuil de 10 % pour l’ensemble des poids attendus (poids théoriques des femelles : 19–26 g ; mâles : 26–33 g). L’intervalle entre deux prélèvements est largement supérieur aux 14 jours requis pour la reconstitution hématologique, ce qui ne justifie pas de compensation systématique. Le volume cumulé par animal sur l’ensemble du protocole sera de 300 µL, compatible avec les recommandations, et les pesées pré- et post-prélèvement garantiront le respect du seuil réglementaire. Enfin, tous les gestes seront réalisés par des expérimentateurs spécifiquement formés, et des points limites prédictifs et adaptés au protocole seront appliqués pour garantir à la fois l’absence de souffrance inutile et la qualité de vie des animaux jusqu’à la fin du protocole.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris a été choisie comme espèce expérimentale car elle est largement utilisée dans les recherches sur l’athérosclérose (maladie des artères) et l’inflammation du cerveau. Elle bénéficie d’un important recul scientifique et de nombreux modèles validés. Le modèle utilisé ici correspond à une lignée de souris génétiquement modifiées, couramment employée pour étudier le développement de plaques dans les artères, similaires à celles observées chez l’humain. Ces souris développent naturellement des lésions dès l’âge de 8 semaines, qui s’accélèrent avec une alimentation riche en graisses. Cela permet de reproduire une forme précoce de la maladie humaine. Par ailleurs, leur système immunitaire est suffisamment proche de celui de l’humain pour évaluer les effets d’un vaccin. Le modèle choisi permet donc d’étudier, dans un même animal, l’impact d’un vaccin antigrippal sur deux organes particulièrement touchés par le vieillissement : les vaisseaux sanguins et le cerveau. Les souris seront incluses dans le protocole à l’âge adulte (9 semaines) et suivies jusqu’à l’âge de 6 mois environ. Pendant dix semaines, elles recevront une alimentation spéciale afin de favoriser l’apparition de plaques dans les artères, sans aller jusqu’à des stades sévères de la maladie. Ce choix permet de tester l’effet du vaccin dans une approche dite de « prévention secondaire », c’est-à-dire avant que n’apparaissent les complications. Au niveau du cerveau, cet âge correspond également à une période où l’on observe des signes précoces d’inflammation, sans atteinte neurologique irréversible. C’est donc une fenêtre idéale pour étudier si le vaccin peut limiter cette inflammation dite « silencieuse ». Enfin, utiliser des souris jeunes adultes permet d’éviter les effets liés à un système immunitaire encore immature (chez les jeunes) ou à un affaiblissement global (chez les plus âgées), assurant ainsi des résultats fiables et plus facilement transposables à l’humain.