Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 15/01/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-903975)
Une perte de poids dépassant 15 %, une posture ou des expressions faciales associées à la souffrance déclenchent la mise à mort de l’animal. 100 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l’issue. Chacune reçoit une injection sous-cutanée de cellules de mélanome, puis une injection intratumorale de microbulles et d’interleukine-12 suivie d’une exposition aux ultrasons, six échographies et un prélèvement de sang. Le porteur décrit une possible ulcération et nécrose de la tumeur, et fixe comme objectif de comparer quatre modes de focalisation du faisceau pour déterminer quel volume tumoral il faut traiter.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet a pour objectif de concevoir une approche thérapeutique reposant sur la délivrance locale d’une molécule immunostimulatrice dans le tissu tumoral par sonoporation. La sonoporation, associant les ultrasons (US) et les microbulles (MB), permet une délivrance localisée des molécules thérapeutiques avec une efficacité élevée et un faible taux de toxicité. Grâce à cette biodisponibilité augmentée, l’efficacité thérapeutique de cette molécule se trouverait amplifiée. Dans le cadre de notre précédente étude, nous avons développé et évalué un protocole thérapeutique dans un modèle murin de mélanome par imagerie in-vivo. Dans le cadre de ce projet, deux objectifs restent à atteindre : Objectif 1 – Évaluer la réponse immunitaire par dosage de cette molécule immunostimulatrice dans le sang et la tumeur et par l’étude de l’infiltration des cellules immunitaires, 48 heures après traitement. Objectif 2 – Évaluer 4 modes de focalisation du faisceau ultrasonore afin de déterminer le volume tumoral nécessaire à traiter pour obtenir l’éradication de la tumeur. La croissance tumorale sera évaluée longitudinalement sur notre modèle murin de mélanome par imagerie in-vivo.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’immunothérapie et en particulier la vaccination à base de cellules immunitaires, a émergé comme une stratégie thérapeutique prometteuse. Cependant, ces vaccins sont générés ex-vivo et réalisés sur mesure pour chaque patient. Ce processus est complexe et coûteux, empêchant la généralisation de cette immunothérapie. La délivrance in-vivo de molécules immunostimulatrices par sonoporation pourrait ainsi permettre de contourner les procédures laborieuses et coûteuses rencontrées dans le développement de ces vaccins et de généraliser à toutes ces immunothérapies anti-cancéreuses.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Sous anesthésie gazeuse : – Injection sous-cutanée des cellules – tous les animaux – 1 fois/animal – 5 min – Injection seule ou coinjection intratumorale du pIL-12 et microbulles et exposition aux ultrasonores – tous les animaux – 1 fois/animal – 12 min – Echographie des tumeurs – 6 fois/animal – 10 min – Prélèvement de sang – 1 fois/animal – 5 min
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nuisance 1 – Contention des animaux est une source de stress. Nuisance 2 – Le point d’injection des cellules tumorales, des microbulles ou de la molécule immunostimulatrice sont susceptibles d’être douloureux. Nuisance 3 – Les souris peuvent développer des signes cliniques traduisant des effets indésirables liées à la croissance tumorale : 1) Détérioration générale de l’état sanitaire, altération sévère des comportements physiologiques (prostration, refus de se nourrir et de boire, locomotion réduite, poils ébouriffés, dos vouté et yeux enfoncés) ; 2) Cachexie associée à une perte de poids de 15% du poids total de l’animal ; 3) Symptomatologie évocatrice: Saignements, urines ictériques, dyspnées ou sibilances… ; 4) Ulcération et nécrose de la tumeur.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Dans le cadre de l’objectif 1, les animaux seront sacrifiés deux jours post-traitement pour prélever du sang et les tumeurs afin de doser l’interleukine-12 sérique et intratumorale, et de mesurer l’infiltration des cellules tumorales. Dans le cadre de l’objectif 2, les animaux seront sacrifiés au 15ème jour post-inoculation avant que les points limites soient atteints.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé un protocole de délivrance d’une molécule immunostimulatrice par sonoporation en exploitant des suspensions des cellules de mélanome et des sphéroïdes de mélanome. Cette approche a permis de réduire le nombre de paramètres de ce protocole. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons délivrer cette molécule dans un modèle murin de mélanome afin d’étudier in-vivo la réponse immunitaire induite par ce protocole et les effets de modes de focalisation des faisceaux ultrasonores sur l’efficacité thérapeutique. Le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d’étude in-vitro ou in-silico car à ce jour aucun modèle d’étude in-vitro ou in-silico ne peut reproduire la complexité d’un système immunitaire in-vivo et la réponse immunitaire anti-cancéreuse.
2. Réduction
Notre précédente étude in-vivo a permis de réviser le nombre de souris par groupe, passant de 15 à 10 souris/groupe. Par conséquent, notre étude nécessite 100 souris. Nous réaliserons une étude statistique pour évaluer la réponse immunitaire de notre protocole et pour déterminer l’efficacité de différents modes de focalisation du faisceau ultrasonore sur l’efficacité thérapeutique de cette immunothérapie dans un modèle murin de mélanome. Par rapport au groupe contrôle, il sera considéré comme significatif : 1) Augmentation de 20% de la molécule thérapeutique dans le sang et la tumeur ; 2) Augmentation de 20% de l’infiltration tumorale des cellules immunitaires ; 3) Diminution de 20% du volume des tumeurs ; 4) Diminution de 15% du poids des animaux.
3. Raffinement
Le stress des animaux est minimisé par l’implication d’un personnel qualifié pour l’expérimentation animale. Après une phase d’acclimatation, ils seront habitués à être sorties de leur cage. Ils seront hébergés en groupe (5/cage) avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés une fois par jour. Toutes les stratégies d’analgésie, d’anesthésie et de soins seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Pendant le protocole, si nous constatons des bagarres dans les cages, nous procéderons à une séparation des individus tout en maintenant un contact visuel, auditif et olfactif. En cas de blessures, nous laverons ces dernières et nous les traiteront avec une solution antiseptique jusqu’à la cicatrisation complète. Pendant le projet, les expressions faciales, la posture de l’animal, la réactivité de l’animal à des stimuli externes (bruit…) seront monitorés chaque jour. Une perte de poids de plus de 15%, une réactivité anormale à des stimuli externes (bruits), une posture et des expressions associées à une souffrance de l’animal impliqueront sa mise à mort. Les souris seront placées dans une boîte d’induction d’anesthésie gazeuse. Dès que les souris auront des signes d’endormissement, elles seront sorties de la boîte d’induction et placées sur une paillasse avec couverture chauffante. Les souris seront maintenues sous anesthésie gazeuse. Une protection oculaire sera appliquée. La respiration (capteur électronique), la température (sonde endorectale) et le poids (balance) seront mesurés pendant la procédure. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement. Les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale d’un agent euthanasiant vétérinaire.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Dans la littérature et pour la lignée cellulaire de mélanome murin B16F10 choisie pour notre étude, l’implantation se fait généralement dans des souris adultes âgées de 5 semaines, physiologiquement matures.