Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 22/05/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-905410)
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet consiste à créer et entretenir une lignée génétiquement modifiée invalidée pour les gènes de deux neuropeptides, avec une biopsie de la queue sous anesthésie pour le génotypage. Les animaux au génotype « inadéquat » sont mis à mort après le génotypage, les reproducteurs trop âgés une fois qu’ils ne produisent plus de portées. Le porteur affirme que l’étude de ces neuropeptides « n’est possible que dans un système intégré » et justifie ainsi le recours à la souris, l’entretien de la lignée servant de support à de futurs projets.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’obésité et le diabète de type II connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans qui fait de la pandémie mondiale de « diabesity » un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que des neuropeptides connus pour jouer un rôle crucial dans le contrôle hypothalamique du comportement alimentaire sont aussi impliqués dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique, c’est à dire dans la capacité du système à maintenir un équilibre de fonctionnement (ici la glycémie) quelles que soient les contraintes extérieures. C’est notamment le cas des Orexines : neuropeptides hypothalamiques, exprimés dans l’aire hypothalamique latérale (LHA) et connues pour stimuler la prise alimentaire. Nos observations montrent que les orexines sont co-exprimées avec le 26RFa, autre neuropeptide hypothalamique de la LHA. De plus, le 26RFa a récemment été décrit comme un nouvel acteur de la régulation centrale de la glycémie. La compréhension du rôle des orexines, de ses mécanismes d’action et des interactions existant entre les deux systèmes neuropeptidergiques (Orexines et 26RFa) pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du diabète de type II. Ce projet vise à entretenir la lignée de souris invalidées (Knock-Out) pour le gène codant les orexines et à obtenir une lignée de souris invalidées à la fois pour les orexines et le 26RFa (double mutant). Ces lignées permettront de caractériser le rôle et les mécanismes d’interaction de ces neuropeptides dans la régulation de l’homéostasie glucidique en contextes physiologique et physiopathologique. L’entretien de la lignée invalidée pour le 26RFa fait l’objet d’une autorisation de projet déjà validée. Les protocoles de recherche utilisant ces souris mutantes seront détaillés dans d’autres projets de recherche spécifiques, ce projet ne concerne que l’obtention et l’entretien des lignées transgéniques.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’utilisation d’approches d’hybridation in situ a permis une première évaluation de l’expression des orexines et du 26RFa dans le système nerveux central. Nous avons observé que ces deux neuropeptides sont conjointement exprimés dans une population de neurones de l’hypothalamus latéral. Si le rôle des neurones à 26RFa dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique a récemment été mis en évidence, le rôle des orexines est, à l’heure actuelle, mal connu. La colocalisation de ces deux systèmes neuropeptidergiques dans les mêmes neurones suggèrent néanmoins qu’ils pourraient tous deux être impliqués et interagir au sein de l’hypothalamus latéral, pour réguler la glycémie. De fait, l’étude de ces modèles de souris invalidés soit pour les orexines seules, soit pour les orexines et le 26RFa, compléteront les études menées chez les animaux invalidés pour le 26RFa seul. Les données obtenues chez ces mutants permettront de caractériser les rôles respectifs de ces neuropeptides et les interactions mises en jeu entre ces deux systèmes dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique et des mécanismes moléculaires sous-tendant leur action.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale (prélèvement d’un bout de queue de 3 mm déstiné au génotypage des animaux) sous anesthésie à l’isoflurane : un seul prélèvement, 5 minutes d’anesthésie.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’élevage et la reproduction d’animaux n’induisent aucun stress ni souffrance particuliers chez les animaux. Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel qualifié, pour déceler tout signe de souffrance : dégradation de l’état général de l’animal avec modifications de l’apparence physique externe (plaies, mauvais aspect du pelage, poil hérissé, dos voûté), et/ou changements du comportement (prostration, léthargie, agressivité inhabituelle lors des manipulations, vocalises), perte de poids importante. Si ‘un de ces signes ou une combinaison de signes apparait, le suivi de l’animal sera renforcé et les soins adéquats seront apportés (désinfection à la bétadine, analgésie assurée par injection de 200µg de buprénorphine, répétée après 4 heures si nécessaire). Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24 heures, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et la mise à mort sera réalisée par décapitation après anesthésie générale à l’isoflurane (5%). Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Afin de réduire une éventuelle souffrance lors d’une mise bas difficile, les femelles seront suivies quotidiennement pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. Au cours de la mise bas, les femelles seront suivies afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal (le processus de mise bas dure en moyenne 2 heures chez la souris). En cas de difficultés au cours de la mise bas (temps de mise bas allongé au-delà de 4h, mise bas non évolutive, premiers petits mort-nés ou mère présentant des signes de détresse…), la mère sera manipulée pour aider à la mise bas.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’ensemble des animaux générés dans ce projet sera destiné à la reproduction et à l’entretien de la lignée 26RFa-/- ; Or-/-. Les animaux de génotype adéquats seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissances à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ne produisant plus de portées seront mis à mort selon les procédures précedemment décrites. Les animaux de génotype inadéquats donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d’animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude du rôle du système neuronal à Orexines et de ses interactions avec le système à 26RFa dans la régulation de l’homéostasie glucidique n’est possible que dans un système intégré et nécessite donc l’utilisation d’animaux modèles.
2. Réduction
La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à obtenir dans les mêmes portées les animaux mutants et les animaux contrôles. Les cohortes d’animaux ainsi produites seront soumises à plusieurs tests physiologiques successifs, en respectant toujours un délai de repos entre chaque test, afin d’évaluer les rôles des orexines et du 26RFa dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique. Cela permettra de réduire le nombre de cohortes produites.
3. Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux reproducteurs seront maintenus à trois par cage pour éviter tout isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d’un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux. Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Pour réduire une éventuelle souffrance liée à la mise bas, les femelles seront suivies quotidiennement pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. La mise bas en elle-même sera étroitement surveillée afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal et l’aide nécessaire sera apportée aux femelles en cas de difficultés au cours de la mise bas. En cas de difficultés (temps de mise bas allongé, mise bas non évolutive, premiers petits mort-nés ou mère présentant des signes de détresse…), la mère sera isolée après avoir reçu 1ml de fluide tiède par voie SC pour la réhydrater. Elle sera gardée dans un endroit calme et chaud. L’abdomen de la mère sera manipulé afin de favoriser l’expulsion des petits. Si l’aide apportée n’est pas suffisante pour déclencher la mise-bas et afin d’éviter une souffrance de la mère, elle sera mise à mort par décapitation après anesthésie générale à l’isoflurane (5%). Les femelles démontrant des signes de dystocie seront mises à mort immédiatement.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes qui n’existe pas chez d’autres modèles mammifères. La mutation ciblée a été créée en utilisant des cellules souches embryonnaires (ES) SM1 dérivées de 129S6/SvEvTac. Cette lignée a ensuite été rétrocroisée en fonds C57Bl/6J au moins 8 fois par le laboratoire donneur. Les animaux mutants pour le gène codant les orexines (lignée murine B6.129S6-Hcrttm1Ywa/J) provenant du Jackson Laboratory seront croisés avec des animaux C57Bl/6J afin d’entretenir une reproduction. La lignée 26RFa-/- (également connue sous le nom Qrfp-/-) utilisée dans ce projet fait l’objet d’une autorisation de projet déjà validée.