Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-948928)
110 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de lipopolysaccharide bactérien directement dans le cerveau par voie stéréotaxique pour induire une neuro-inflammation, puis des injections d’un candidat-médicament et une imagerie TEP sous anesthésie avec un traceur radioactif. Le porteur indique que l’inflammation peut provoquer un état fébrile, une perte d’appétit et une léthargie, et prévoit la mise à mort en cas de signes de détresse. Il affirme qu’il est « nécessaire » de valider l’effet des molécules chez « l’animal entier et vivant » et retient uniquement des mâles pour limiter la variabilité.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les pathologies du système nerveux central ne sont que faiblement couvertes par les molécules thérapeutiques actuelles et l’efficacité des traitements est parfois limitée. Face à ce constat, les stratégies thérapeutiques se tournent aujourd’hui vers une population cellulaire de plus en plus considérée que sont les cellules gliales et en particulier, les astrocytes, acteurs majeurs de la réponse inflammatoire. Ces processus neuro-inflammatoires, associés à une multitude de maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, atrophie multisystématisée ou sclérose en plaques par exemple) sont encore mal connus. La protéine translocatrice de 18kDa (TSPO), est considérée comme une cible de référence pour visualiser et quantifier la neuro-inflammation. Cette protéine est la plus étudiée actuellement au moyen de différents traceurs radioactifs par Tomographie par émission de positons (TEP). Elle est ainsi pour notre étude, un atout majeur pour la mise en évidence d’efficacité de candidats-médicaments pour certaines pathologies du système nerveux central. Un des modèles de prédilection dans l’étude de la neuro-inflammation est le modèle par administration de lipopolysaccharide (LPS), élément bactérien déclenchant une cascade de réactions inflammatoires dans l’organisme. Nous travaillerons sur un modèle d’inflammation chez le rat par administration stéréotaxique unilatérale de LPS. Ce modèle est reconnu pour l’étude de la neuro-inflammation chez l’animal, dont les données comportementales, phénotypiques et d’imagerie sont bien décrits dans la littérature. Ce modèle est certes plus contraignant que l’injection systémique, mais il présente l’avantage de produire une inflammation plus spécifique dans le cerveau (une inflammation généralisée pouvant entrainer une captation non spécifique du traceur et donc une réponse non-spécifique de nos candidats-médicaments). Ainsi, nous souhaitons évaluer l’effet de candidats-médicaments sur la neuroinflammation chez ce modèle par imagerie TEP du TSPO.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels. Il est nécessaire de revisiter certains concepts pharmacologiques afin d’ouvrir le champ à de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce contexte, la neuroinflammation apparait comme un processus physiopathologique d’intérêt car ce phénomène est exacerbé dans de nombreuses pathologies du cerveau, ce qui contribue aux symptômes des patients. La neuroinflammation est induite par la sécrétion de médiateurs moléculaires pro-inflammatoires par les cellules gliales dans le cerveau. Une stratégie thérapeutique prometteuse serait donc de réduire la production de médiateurs de l’inflammation dans un contexte de neuroinflammation. Ainsi, l’enjeu de cette étude est d’évaluer grâce à l’imagerie TEP de la TSPO (une protéine surexprimée par les cellules gliales lors de la neuroinflammation), l’efficacité de candidat-médicaments à réduire la neuroinflammation. Ces candidats-médicaments sont sélectionnés sur la base de données préliminaires suggérant leur capacité à réduire la sécrétion de médiateurs inflammatoires. Des analyses immunohistochimiques complémentaires permettront de préciser davantage le mécanisme d’action cellulaire et moléculaire des candidats-médicaments dans le cerveau. Ce projet pourrait mener à l’identification d’un candidat-médicament efficace dans le traitement des maladies du système nerveux central.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les 110 animaux effectueront une procédure comprenant 2 interventions majeures : 1) Injections stéréotaxiques dont l’objectif est la mise en place du modèle inflammatoire (durée : 45 minutes) • Réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) et analgésie • Sur la totalité des animaux décrits dans cette demande de projet : 110 rats • Chaque animal subira de manière unilatérale, une injection stéréotaxique dans une région d’intérêt d’une endotoxine (le lipopolysaccharide ; LPS) • Immédiatement après l’injection stéréotaxique, les animaux recevront une injection intrapéritonéale du candidat-médicament. Ils recevront également une injection du candidat-médicament 1 jour et 2 jours après la chirurgie. 2) Imagerie TEP /TSPO dont l’objectif est la visualisation de la neuro-inflammation (durée : 1h30) • Un examen d’imagerie TEP/CT avec injection intraveineuse d’un radiotraceur, le [11]PK11195, sera réalisé sous anesthésie générale (isoflurane), 3 jours après l’injection stéréotaxique • Sur la totalité des animaux décrits dans la demande
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux subiront l’injection stéréotaxique dans un état d’anesthésie générale sous isoflurane, et sous analgésie (buprénorphine, et lidocaïne en local). Les effets indésirables attendus sur ces animaux sont l’inflammation locale et en particulier le déclenchement de médiateurs de l’inflammation dans le cerveau. Cette neuroinflammation modérée et locale peut provoquer un état fébrile temporaire dans les heures suivant l’injection, se traduisant par une pilo-érection, une perte d’appétit et une léthargie. De plus, une nuisance possible de cette procédure serait l’apparition d’hémorragie lors de la chirurgie ou bien d’infection éventuelle à la suite de celle-ci. Le protocole est alors optimisé pour que les risques de ces complications soient minimes (zone opérée réduite au maximum, nettoyage et désinfection de la zone, stérilisation du matériel).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le projet et la procédure utilisée ont été choisis après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Etant donné la complexité du phénomène de neuroinflammation, il est nécessaire de valider l’effet des médicaments-candidats chez l’animal entier et vivant pour établir un effet thérapeutique avec un niveau de preuve suffisant pour justifier de futurs essais cliniques. L’utilisation de modèles in vitro, préalable à cette étude, s’inscrit dans une logique de sélection des composés les plus prometteurs mais ne dispense pas de vérifier l’efficacité in vivo des produits à l’issue de cette première phase de sélection.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisé dans la recherche de molécules thérapeutiques de ce projet, un criblage in vitro a permis en amont de réduire considérablement le nombre de candidats-médicaments sur la base de leur toxicité et leur d’efficacité. Un minimum de 8 animaux par condition est requis afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour détecter une taille d’effet de 7%, avec une variabilité de 5%, une puissance de 80% et un risque alpha de 5%. Le nombre final d’animaux par groupe a été choisi à 10 pour garantir cette puissance statistique en cas de perte éventuelle d’animaux au cours du protocole, tout en le réduisant à son minimum (selon notre expérience de ces conditions expérimentales, nous estimons une perte de données maximale de 2 animaux par groupe, incluant les éventuels décès suite à la chirurgie mais aussi les éventuelles images TEP non interprétables par passage du radiotraceur insuffisant en intraveineux). Concrètement, les données expérimentales générées seront traitées à l’aide d’un test d’analyse de variance à une dimension (one-way ANOVAs). Les résultats seront exprimés en moyennes affectées de l’erreur standard. La distribution normale des données sera d’abord testée et si tel est le cas, un test paramétrique sera utilisé (one-way ANOVAs) sinon un test non-paramétrique équivalent sera utilisé (Kruskal-Wallis).
3. Raffinement
L’injection stéréotaxique sera réalisée sous anesthésie générale et locale, et analgésie générale. L’acquisition TEP sera réalisée sous anesthésie générale. Les animaux seront surveillés tous les jours grâce à une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte l’éventuel état fébrile observable dans les heures suivant l’injection de LPS. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boîtes ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le rat constitue un modèle animal pour lequel il existe de nombreuses données précliniques impliquant les différentes méthodes utilisées au sein de ce projet. De plus, l’utilisation du rat se justifie également par la taille du cerveau de cette espèce (plus importante que celle de la souris) favorable en TEP. Rats Mâles : Similairement aux autres études réalisées sur ce modèle et afin de limiter une possible variabilité dans notre étude (le LPS induisant des effets différents en fonction du sexe) et de réduire au maximum le nombre d’animaux, le choix se porte uniquement sur le sexe masculin.