Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 05/11/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-954957)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif de ce projet est de réaliser les tests selon la ligne directrice OCDE 203 et de répondre ainsi à une exigence réglementaire qui consiste à caractériser les dangers et risques associés à la production et l’utilisation de nos produits. Le test OCDE 203 est destiné à déterminer les effets léthaux et sub-léthaux des produits chimiques sur le poisson zèbre et consiste à exposer les poissons à une série de 5 concentrations du produit chimique dissout dans l’eau, les effets étant comparés à un lot témoin non exposé. Les mortalités et les anomalies visibles relatives à l’apparence et au comportement sont enregistrées. Dans la mesure du possible, les concentrations qui ont un effet sur 50% des poissons (CL50) sont déterminées.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce test fait partie d’un ensemble de tests d’écotoxicité imposé par certaines réglementations (REACh notamment), il n’est réalisé qu’à la demande des autorités compétentes. En absence de réponse à cette exigence, les substances ne pourront plus être produites et/ou utilisées en Europe (les substances concernées sont des monomères produits par notre société et relevant notamment du règlement REACh qui s’applique aux produits chimiques hors biocides et produits phytosanitaires).
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Le test consiste à exposer des animaux juvéniles à une série de 5 concentrations du produit chimique testé dissout dans l’eau pendant 96 heures. Les points d’observation suivants, spécifiés dans la ligne directrice, seront relevés 2 fois par jour: – survie (les animaux morts sont retirés dès qu’ils sont repérés) – anomalies visibles (perte d’équilibre, tête en haut ou en bas, poisson flottant ou coulant, pigmentation, exophtalmie) – comportement ventilatoire (hyperventilation, hypoventilation ou ventilation irrégulière) – comportement natatoire (hyperactivité, hypoactivité, immobilité, convulsions, nage près de la surface ou du fond, augmentation ou diminution de la nage en groupe ou en banc) En cas de malformations et apparence anormale telles que l’organisme est en état de souffrance considérable et irréversible, celui-ci sera retiré de l’essai et euthanasié. Les effets léthaux et subléthaux sont évalués et comparés aux valeurs témoin pour déterminer la concentration la plus basse pour laquelle on observe un effet, et la concentration sans effet observé.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Selon les substances et les concentrations testées, les nuisances attendues tout au long de la période d’essai peuvent être les suivantes : stress, douleur, comportement anormal, ralentissement anormal de la croissance (en termes de taille et de prise de poids comparé au lot témoin). L’absence de nourrissage (imposé par la ligne directrice), de même que le changement d’eau lors des tests en conditions semi-statiques peuvent également avoir pour conséquence du stress pour l’ensemble des animaux). Parmi ces atteintes, seules celles définies comme étant des points limites auront pour conséquence une euthanasie des organismes concernés. Le protocole d’essai est clairement établi et ne peut être dérogé sous peine d’invalidité du test réalisé. La gamme d’essai étant choisie de sorte que la plus faible concentration testée ait environ 10% d’effet et la plus forte concentration environ 90%, nous considérons que les animaux exposés aux 2 plus faibles concentrations subiront un degré de gravité modéré et les animaux exposés aux 3 concentrations les plus élevées un degré sévère. Les organismes témoins subiront un degré de gravité légère.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux exposés à la substance ne peuvent pas être réutilisés et doivent être euthanasiés. Les animaux témoins sont replacés dans le système d’hébergement et pourront être réutilisés après une période de quarantaine de 7 jours minimum
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Aucun test in vitro n’ayant été validé par les autorités, il ne sera procédé à aucun test in vitro en amont. Le test de toxicité selon la ligne directrice OCDE 203 est le seul test validé par les autorités compétentes, il n’est réalisé que sur leur autorisation, obtenue pour chacune des substances testées.
2. Réduction
Pour chaque test, le nombre d’animaux utilisé est défini par le protocole d’essai et ne peut être diminué. Cependant, la ligne directrice autorise la possibilité de réaliser un pré-test permettant de définir les conditions exactes du test définitif, notamment la gamme de concentrations. Ce prétest est réalisé sur un nombre de concentration et de réplicat plus faibles. Afin de limiter le recours à ce test préliminaire, nous définissions nos gammes de concentrations à partir de données de toxicité aiguë déjà disponibles sur chacune de nos substances et obtenues sur d’autres organismes (algues et daphnies notamment). Ce processus permet également de réduire le risque d’invalidation d’un test dans le cas où la gamme de concentrations choisie ne permettrait pas d’atteindre les objectifs (par exemple dans le cas de concentrations trop élevées qui entraineraient une mortalité excessive ne permettant pas d’analyses statistique fiable. Dans cette situation nous serions obligés de recommencer le test et donc d’augmenter le nombre d’animaux utilisés).
3. Raffinement
Les organismes sont commandés auprès de fournisseurs disposant de l’agrément européen. Dès réception, les poissons sont transférés dans un local indépendant où se situe le système d’hébergement. Ils sont d’abord versés dans un aquarium « tampon », puis l’eau de transport est progressivement diluée avec l’eau provenant du système d’hébergement (on remplace 1L tous les 1/4h environ). Les poissons sont maintenus dans un milieu à 50% de dilution pendant au moins 30 minutes puis sont transférés à l’aide d’une épuisette dans le système d’hébergement final (environ 6 individus par bac de 3.5L). Une période d’observation de 2 semaines minimum est respectée afin de valider le lot reçu. Le système d’hébergement est une armoire spécifiquement dédiée à l’hébergement des poissons, composée de racks d’aquariums de 3.5L sous lesquels un visuel de gravier a été ajouté pour améliorer le bien-être des animaux. Le système régule la température à 26°C et le renouvellement du milieu (composé d’eau osmosé et de sels minéraux); des sondes associées à un système d’alarme contrôlent en permanence la température, le pH et la conductivité. Les techniciens contrôlent à minima une fois par semaine les paramètres oxygène dissous, nitrates, nitrites, ammoniaque et dureté. Ils assurent également quotidiennement l’apport en nourriture (aliment en poudre, daphnies et artémias). Une photopériode de 16h de jour/8h de nuit est appliquée automatiquement. Les organismes soumis au test OCDE 203 (organismes témoins et organismes exposés à la substance testée) seront placés dans des aquariums nus (un visuel de gravier sera ajouté à l’extrérieur des aquariums) et maintenus dans des conditions environnementales équivalentes au système d’hébergement. Des points limites nécessitant une euthanasie des individus concernés ont été définis en accord avec notre vétérinaire sanitaire (dans le cadre de l’hébergement et des tests de toxicité). Dans le cadre de raffinement, la nourriture vivante (daphnies et artémies) est privilégiée pour les organismes hébergés. Lors des tests, les animaux ne sont pas nourris.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le Danio rerio est une des espèces recommandées par la ligne directrice qui précise que l’espèce doit être choisie en fonction de sa disponibilité immédiate, de sa facilité d’entretien et de son utilisation historique. Nous utilisons le Danio rerio comme organisme modèle depuis plus de 20 ans pour d’autres projets (dont le test de toxicité aux premiers stades de la vie du poisson). Notre fournisseur est français, agréé et reconnu pour la qualité de son élevage. La ligne directrice requiert que des juvéniles de 1 à 2 cm soient utilisés dans cet essai.