Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-955216)
1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles transgéniques de la maladie d’Alzheimer, elles subissent une injection virale intracérébrale à la naissance, des injections d’un inhibiteur et des tests comportementaux dont la piscine de Morris où elles sont contraintes de nager. Le porteur qualifie la photobiomodulation d' »absolument indolore » et présente l’isolement en actimétrie comme sans conséquence, tout en reconnaissant que la nage est un « environnement stressant ». Il affirme que ces tests de comportement ne peuvent pas être remplacés in vitro, ses analyses moléculaires étant menées en parallèle sur cellules.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les patients souffrant de la maladie d’Alzheimer (MA) présentent dans leur cerveaux des plaques séniles dont le composant majeur est le peptide amyloïde (Ab). Chaque individu produit et dégrade de manière physiologique ce peptide Ab mais une accumulation anormale de ce peptide pourrait être à l’origine de la maladie. Nos résultats montrent que le fragment C99, le précurseur direct du peptide Ab, pourrait être tout aussi pathogène. Au laboratoire, nous avons mis en évidence une accumulation très précoce du C99 dans un modèle de souris triple transgéniques 3xTgAD modèle de la MA. Cette accumulation précoce du C99 induit un dysfonctionnement cellulaire au niveau de la dégradation lysosomale et autophagique et contribue au phénotype de type apathique et au deficit cognitif des souris. Plus recemment nous avons montré que le fragment C99 est aussi responsable d’un dysfonctionnement mitochondrial au niveau de la structure, de la fonction et de la dégradation des mitochondries. La photobiomodulation (PBM) qui consiste à exposer des souris à la lumière infrarouge est connue pour ses vertues protectrices en activant notamment la fonction mitochondriale. Cette approche sûre et non invasive a déjà prouvée son efficacité dans plusieurs essais cliniques dédiés au traitement de lésions cérébrales chroniques, à la réparation de la moelle épinière ou à la maladie de Parkinson. Concernant la maladie d’Alzheimer plusieurs études précliniques sont en cours et l’objectif de ce projet est d’étudier dans plusieurs modèles murins de MA, le mécanisme moléculaire par lequel la PBM peut protéger spécifiquement contre la toxicité précoce médiée par le C99.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Mon projet a pour but pricipal d’étudier l’effet protecteur et bénéfique de la photobiomodulation sur des modèles murins de maladie d’Alzheimer. Ce projet de recherche fondamentale devrait apporter des informations importantes concernant la toxicité mitochondriale médiée par le fragment C99 et permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie d’Alzheimer. Il devrait également fournir des perspectives cruciales pour une future application de la photobiomodulation dans le traitement clinique de la maladie d’Alzheimer.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux subiront au plus 5 interventions: La photobiomodulation (procédures 1 à 5) : 90s à 670 nm 2 fois par jour pendant 2 mois; L’actimetrie (procédures 1 à 5): 2 passages dans l’actimètre (avant et après la photobiomodulation) pendant 2jours et 2nuits consécutives; La piscine de Morris (procédures 2, 3 et 5): 5 jours d’apprentissage avec 4 essais par jour, 2 tests 24h et 72h après le dernier jour d’apprentissage et un test visible comportant 3 essais le même jour; L’administration du D6 (procédures 4 et 5) par injection intraperitonéale (30mg/kg/jour) d’environ 150µl par jour pendant 18 jours; L’injection virale (procédures 5) par injection intracérebroventriculaire à la naissance (4μL de particule virale à 5. 10puissance12 en 15 sec)
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La photobiomodulation est absolument indolore et inoffensive pour les souris. Au cours du test de la piscine de Morris, les souris sont contraintes à nager dans l’eau, un environnement stressant. Le test d’actimétrie consiste à isoler les souris dans des cages individuelles 2 jours et 2 nuits consécutives pour comptabiliser les mouvements de chaque souris. Ce test peut éventuellement générer un léger état d’anxiété lié à l’isolement social mais nous estimons que la durée n’est pas suffisament longue pour avoir une quelconque conséquence pour le bien être des animaux. L’injection de virus se fait avec une aiguille qui pénètre dans la peau et le crâne du souriceau sans aucune douleur apparente et sans réaction inflammatoire. L’injection intrapéritonéale de l’inhibiteur D6 sera surveillée de près pour prévenir toute eventuelle inflammation du péritoine.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront sacrifiés afin de récupérer leur cerveau et effectuer les analyses biochimiques et histologiques nécéssaire au projet scientifique.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les expériences de comportement de souris telles que la piscine de Morris ou l’actimétrie ne peuvent malheureusement pas être remplacées par des expériences in vitro. Cependant toutes nos expériences biochimiques, immunohistologiques et nos analyses des mécanismes moléculaires sont au préalable étudiées sur des modèles cellulaires exprimant les mêmes mutations (cellules SH-SY5Y-APPswe) ou les mêmes fragments (C99) que nos modèles murins. De plus, actuellement dans notre laboratoire, nous mettons en place l’utilisation de fibroblastes ou d’iPSC de patients Alzheimer atteints de formes sporadiques ou familiales. Ceci constituera aussi un bon modèle in vitro de la maladie d’Alzheimer qui viendra compléter nos modèle murins.
2. Réduction
Nous utiliserons des tailles d’échantillons garantissant une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés dans le respect éthique de la règle des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Le nombre de souris pour chaque procédure est ainsi déterminé avec le logiciel G*power. Les tests de comportement que nous utilisons ont déjà été testés sur nos modèles de souris et nous avons déjà établi un protocole bien déterminé ce qui évitera de réaliser des expériences préliminaires de mise au point. Notre étude comportementale requière des groupes de 30 à 45 animaux minimum. Cependant, pour réduire le nombre d’animaux, les mêmes groupes de souris seront utilisés pour plusieurs test comportementaux et pour les analyses biochimiques et immunohistochimiques.
3. Raffinement
Nos modèles de souris sont utilisés en routine dans notre laboratoire et sont désormais très bien caractérisés. Ainsi pour chaque modèle, nous connaissons très bien la cinétique d’apparition et d’évolution de la pathologie pour déterminer les âges adéquats et pouvoir traiter nos souris en préventif (4 mois) ou en curatif (12mois). Pour atténuer au maximum le stress causé par le test de la piscine de Morris pour lequel les souris sont contraintes de nager dans l’eau, une phase d’habituation sera réalisée avant le début du test. La température de l’eau est fixée à 22°C et permet un bon équilibre entre motivation et bien-être de l’animal et dès la sortie de l’eau, les souris seront séchées sur un papier absorbant. Après l’injection de virus, les souriceaux sont replacés avec leur mère le plus rapidement possible pour éviter tout rejet de la mère. Pour limiter le stress, les souris sont hébergées dans des cages comportant une maisonnette ainsi que de la ouate favorisant la nidification. L’injection intrapéritonéale de l’inhibiteur D6 sera surveillée de près pour prévenir toute eventuelle inflammation du péritoine. Pour définir le plus objectivement possible le bien être des souris et assurer au mieux leur survaillance tout au long de chaque procédure, nous utiliserons une grille de scores (voir annexe) et nous nous référons aux points limites.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Pour déterminer in vivo si la PBM est bénéfique dans le traitement contre la maladie d’Alzheimer au niveau de la cognition, nous sommes contraints d’utiliser des modèles de souris mimant la maladie et présentant des déficits cognitifs comme les souris 3xTgAD. Les souris 2xTgAD et les souris AAV-C99 seront ensuite utilisées pour étudier in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans l’effet neuroprotecteur de la PBM et pour vérifier que la PBM agit bien sur la toxicité liée au fragment C99 et non pas sur le peptide Ab. Cette information est importante pour déterminer la meilleure cinétique de traitement étant donné que le C99 intervient de manière beaucoup plus précoce que l’Ab. En tenant compte de nos résulats antérieurs, nous avons choisi de tester l’effet neuroprotecteur de la PBM chez les souris 3xTgAD à 2 âges : un âge précoce (4mois) où seule l’accumulation du fragment C99 est présente pour voir si la PBM est capable d’améliorer le comportement de type apathique déjà visible (actimétrie); et un âge plus tardif (12mois) où la pathologie associée au peptide Ab s’ajoute à l’accumulation du C99 pour voir si la PBM est capable de restaurer les déficits cognitifs et le retard d’apprentissage spatial présent à cet âge (Piscine de Morris). Concernant les souris AAV-C99 nous avons choisi de tester l’effet neuroprotecteur de la PBM à 6 mois puisqu’un déficit d’apprentissage spatial a déjà été observé à cet âge.