Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/04/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-967551)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les cellules souches du muscle squelettique (aussi appelées cellules satellites) sont essentielles dans le processus de la régénération musculaire, et pourraient être la population cellulaire clé pour les thérapies géniques pour lutter contre des myopathies. Par contre, ces cellules sont entourées par plusieurs autres types de cellules. Les thérapies géniques pour certaines maladies musculaires pourraient être améliorées en utilisant des vecteurs de gènes ciblant spécifiquement ces cellules souches, et en évitant ainsi l’expression des gènes apportés (transgènes) dans d’autres populations cellulaires, qui pourraient déclencher des réponses immunitaires. Nous allons utiliser des virus adéno-associé (AAV) pour tester des séquences régulatrices de gènes seulement exprimés dans les cellules satellites, afin de créer des vecteurs qui peuvent cibler les cellules souches du muscle squelettique. Des rats sauvages ou avec une dystrophie musculaire provoquée par mutation du gène Dmd, responsable de la production de la dystrophine, seront injectés par voie intramusculaire avec les AAVs. Le ciblage des cellules souches sera examiné par analyse en immunofluorescence sur coupe histologique et cytométrie en flux.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à identifier des séquences d’ADN qui permettent une expression spécifique des transgènes dans les cellules souches du muscle squelettique. De telles séquences ne sont pas connues à ce jour, donc cette identification représentera une avancée importante dans notre connaissance du ciblage et de la régulation génique dans les cellules souches. Du point de vue clinique, ces séquences seraient essentielles pour des thérapies géniques ciblées pour les cellules souches, pour éviter des effets non-ciblés et des réponses immunitaires.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Dans ce projet, les animaux recevront une injection intramusculaire sous anesthésie.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nous attendons une douleur légère liée avec l’injection intramusculaire, qui sera traitée avec des analgésiques pendant deux jours suivant l’injection. Les rats DMD ne présentent pas des effets délétères majeurs du phénotype avant l’âge de 10 mois, et dans ce projet, ils seraient mises à mort à l’âge de 1,5-2 mois.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nous réalisons des cultures de myoblastes en première intention pour tester nos séquences d’intérêt. Malheureusement, ces cultures restent loin de la situation in vivo puisque les vraies cellules souches du muscle sont quiescentes chez l’adulte, se divisant rarement, ce qui rend impossible la mise au point d’un système d’étude représentatif in vitro. De plus, nos expériences antérieures ont montré que certaines séquences prometteuses en culture n’avaient pas toujours une activité spécifique in vivo. Compte tenu de ces contraintes, il reste nécessaire de valider les séquences selectionnées dans un modèle animal.
2. Réduction
Le calcul de puissance statistique nous recommande d’utiliser 8 rats par AAV et point de temps. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés pour lesquels nous avons pu conclure de façon significative.
3. Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la règlementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à l’âge d’un mois. L’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel par ailleurs compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Une grille d’évaluation critériée de la douleur et des points limites pour cette lignée a été établie. Les rats seront constamment évalués en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Toute atteinte des points limites sera suivi d’une action correctrice précisée sur la grille. En cas d’absence de bénéfice (trouble irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous avons choisi le rat pour des raisons multiples. D’abord, nous utilisons un modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne dans le rat, qui récapitule le phénotype humain. Le rat est aussi un mammifère, et beaucoup des séquences d’ADN que nous allons mettre dans les AAVs sont conservées chez l’humain. Donc si une séquence a une activité forte dans des cellules de rat, il est probable que cette activité sera maintenue dans les cellules humaines. Pour les rats utilisés en procédure 1, les AAVs seront injectés à 4 semaines d’âge, quand le muscle se forme toujours, parce que les cellules souches du muscle sont plus accessibles au virus à ce stade.