Tests réglementaires

Capturées, gardées jusqu'à trois jours en vivier dans l'obscurité, anesthésiées à trois reprises puis marquées par insertion d'une marque dans la cavité ventrale au trocart, 90 anguilles européennes de dix à vingt ans subissent ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces poissons migrateurs menacés sont ensuite lâchés dans les dispositifs de dévalaison d'un barrage de douze mètres, pour vérifier que ces installations neuves ne les blessent pas et ne les tuent pas, une vérification imposée par arrêté inter-préfectoral. Le porteur annonce un saignement léger à l'incision, une douleur modérée de courte durée, une perte de mucus, et des blessures possibles au passage dans les dispositifs. Les 90 anguilles sont comptées comme relâchées dans la rivière, alors que le protocole prévoit aussi qu'une "mise à mort par surdosage progressif d'anesthésiant pourra être justifiée par atteinte des points limites".

Objectifs

L’étude vise à vérifier l’innocuité (absence de blessures ou de mortalité) de nouveaux systèmes permettant la migration des anguilles au niveau d’un grand barrage (12m de haut, 150 mètres de large). En effet, l’anguille est un poisson migrateur menacé qui doit effectuer une migration vers la mer pour se reproduire. Historiquement, les anguilles étaient bloquées une partie de l’année au niveau de ce barrage. Pour migrer, certaines tentaient de passer dans les canalisations du barrage, ce qui engendrait des blessures ou de la mortalité sur une partie des anguilles. Les nouveaux systèmes mis en place sont novateurs et apparaissent plus sécurisés. Ils doivent cependant être testés in situ pour vérifier qu’ils ne causent pas de blessures ou de mortalités. Il s’agit d’une étude réglementaire, fixé par arrêté inter-préfectoral.

Bénéfices attendus

L'étude permettra de vérifier l'innocuité des nouvelles installations permettant la migration de dévalaison des anguilles. Dans le cas où des blessures et/ou une mortalité seraient observées, des améliorations sur les dispositifs pourront être réalisées. A l’inverse, si les tests s’avèrent satisfaisants, ces nouveaux dispositifs pourront être installés sur d’autres barrages et ainsi réduire les mortalités d'anguilles à une plus large échelle afin d'améliorer la conservation de l'espèce.

Procédures

Stabulation en vivier pendant 3 jours maximum. Anesthésie, à 3 reprises pendant environ 10 minutes. Marquage par insertion d'une marque dans la cavité ventrale au trocart (tige cylindrique creuse), une seule fois par poisson, la durée de l'intervention est estimée entre 1 et 2 min maximum.

Impact sur les animaux

Nuisance par la capture : stress, perte de mucus (substance de protection de la peau du poisson). Nuisances induites par la biométrie : stress ,perte de mucus, dessication, éblouissement. Nuisances induites par le marquage : saignement léger lors de l'incision, stress, douleur modérée de courte durée, gêne légère par la présence de la marque. Nuisances induites par le passage dans les nouveaux dispositifs : stress, blessures

Devenir

Poissons remis en liberté dans la rivière

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude d'innocuité qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans le milieu naturel. La reproduction de l'anguille n'est pas maitrisée, les anguilles d'élevages proviennent tous d'alevins sauvages (civelles). Il n'est pas possible de remplacer l'anguille par une autre espèce.

Réduction

Le projet est prévu sur un maximum de deux années. Il prévoit le marquage de 90 individus afin de s'adapter à la migration annuelle de dévalaison qui est très variable selon les années. Ainsi, Il est prévu d’utiliser 3 lots d’individus : un lot de 30 individus pour tester le déversoir de crue, un lot de 30 individus pour tester la conduite de dévalaison avec le pompage de la prise d’eau en service, un lot de 30 individus pour tester la conduite de dévalaison avec le pompage de l’usine à l’arrêt.

Raffinement

Des mesures de Raffinement sont prises pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse infligées aux anguilles. Pour toutes les phases de stabulation avant et après marquage, les anguilles sont maintenues dans de l’eau bien oxygénée et dans une totale obscurité. Avant le marquage, les anguilles sont préalablement anesthésiées. Pour le marquage, le poids de la marque sera inférieur à 2% du poids du poisson afin de s’assurer qu’aucune modification comportementale ne soit susceptible d’entrainer des biais. Les anguilles présentant un état sanitaire externe anormal (maigreur, blessure, ...) ne seront pas marquées. Pour le marquage, les marques et la zone de marquage sont désinfectées pour prévenir les infections. L’intervention de marquage est rapide et maitrisée, 1 à 2 minutes, permettant un retour rapide dans le bac de réveil. Lors de la remise à l'eau de l'anguille, un contrôle des températures d'eau bac de réveil/milieu récepteur est effectué afin de garantir l'absence de choc thermique. La remise à l'eau s'effectue lorsque l'anguille est totalement réveillée et à proximité d'un habitat constituant une cache préférentielle pour l'anguille. Une mise à mort par surdosage progressif d’anesthésiant pourra être justifiée par atteinte des points limites.

Choix des espèces

Les dispositifs de dévalaison ont été conçus spécifiquement pour l'anguille qui est présente naturellement sur le site d'étude. Il n'est donc pas pertinent d'utiliser un autre modêle biologique. Il s'agit d'anguilles dîtes "argentées". Ces individus sont agés de 10 ans à 20 ans et présentent des tailles approximativement comprises entre 300 mm et 900 mm.

Les souris employées ici portent une mutation qui permet de tuer sélectivement leurs propres cellules du foie par injection, et un système immunitaire délibérément détruit, deux conditions qui rendent possible la greffe d'hépatocytes humains. 8 800 d'entre elles vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à huit injections du composé qui tue leurs hépatocytes, une greffe de cellules par la veine porte, jusqu'à deux puçages sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, le porteur signalant un risque hémorragique accru, une anémie possible et une gêne du transit intestinal. L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique, le porteur l'établissant d'après les études des années antérieures et "en accord avec le plan commercial". 8 600 souris sont tuées, 200 réutilisées dans d'autres projets, dont une formation interne aux gestes techniques sur souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales (e.g. hépatites), le cancer du foie ou des maladies métaboliques telles que la MASH (Metabolic dysfunction-Associated Steato Hepatitis), ou encore de traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines (greffe d’hépatocytes). Dans certains cas, l’humanisation du système immunitaire, en complément d’un foie humanisé, est essentielle pour étudier des processus physiopathologiques complexes, notamment dans le cadre de maladies métaboliques (par exemple, la MASH) ou d’infections virales (comme la dengue). Pour répondre de manière optimale aux objectifs scientifiques et aux questions posées, une double humanisation des souris, incluant à la fois le foie et le système immunitaire, pourra être mise en œuvre. Les cellules hépatiques humaines, et le cas échéant les cellules immunitaires humanisées, pourront ensuite être utilisées pour des études ciblées, comme l’infection par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire fidèlement le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable, bien caractérisée sur le plan génétique. Une souche de souris au foie non humanisé sera utilisée. Elle présenten une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas d’insuffisance hépatique. Par ailleurs, étant fortement immunodéprimée, elle est également permissive, après myéloablation, à la greffe des cellules souches hématopoïétiques ou cellules immunitaires humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Lorsque nécessaire, il sera également possible d’humaniser simultanément les compartiments hépatique et immunitaire. Cette double humanisation constitue un avantage majeur, car elle permet de modéliser de manière plus fidèle les interactions complexes entre le foie et le système immunitaire humain, en particulier dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. Par ailleurs, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus spécifiques à l’humain, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, mieux caractérisée sur le plan génétique, et plus acceptable sur le plan éthique que l’utilisation de primates non-humains. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée offrent également des opportunités pour explorer les mécanismes d’insuffisance hépatique et développer des thérapies adaptées à cette pathologie. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’étudier les réponses immunitaires humaines dans des contextes complexes, tels que les traitements antiviraux ou les pathologies impliquant des mécanismes immunitaires.

Procédures

En fonction des besoins expérimentaux, les souris pourront recevoir, sous anesthésie générale, une puce classique et/ou une puce permettant la mesure de la température corporelle. En cas de perte ou de non-fonctionnement de leur puce électronique, elles pourront recevoir une nouvelle puce avec au maximum deux puçages pendant leur durée de vie. Des prélèvements sanguins seront réalisés avec ou sans anesthésies. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Un maximum de 8 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. À l’issue des études, les animaux non intégrés aux essais précliniques seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par : -identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -injections : douleur abdominale transitoire, et pour l’agent myéloablatif effets hématologiques possibles -actes chirurgicaux : douleur, risque hémorragique, risque anesthésique, défaut de cicatrisation -traitements et prélèvements sanguins : douleur, hématome ou lésion au point d’injection, anémie en cas de prélèvements répétés -injection d’hépatocytes via la veine porte : gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant, risque hémorragique accru -imagerie sous anesthésie : hypothermie, déshydratation, sécheresse oculaire (gel ophtalmique en prévention).

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Dans le cadre d’une réutilisation et afin d’affiner le protocole, les animaux issus des procédures « Humanisation du foie des souris via injection splénique d’hépatocytes » et « Humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte » pourront être utilisés dans la procédure « Mise au point d’un modèle de double humanisation : foie + système immunitaire » de ce même projet.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de 5 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de l’implantation d’un patch contenant des hépatocytes humaines, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes de cette procédure, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas d’insuffisance hépatique. Par ailleurs, cette souche étant fortement immunodéprimée, elle est également permissive, après myéloablation, à la greffe des cellules souches hématopoïétiques ou cellules immunitaires humaines. De plus, cette souche et ses dérivés présentent une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 12 semaines. Il a été néanmoins décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non. L'insuffisance hépatique pourra être induite chez la souris immunodéficiente par exemple par une ou plusieurs injection(s) causant la mort des hépatocytes murins, permettant ainsi d’étudier l’effet d’un implant contenant des hépatocytes.

Tonte, abrasion de la peau à la bande adhésive puis au dermaroller, avant l'application de bactéries destinées à provoquer une infection cutanée : 224 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les lésions attendues sont des rougeurs, des papules, des pustules et des croûtes, avec des démangeaisons, certains prélèvements se faisant par introduction d'une aiguille dans la lésion. Chaque chien porte une collerette pour l'empêcher de se lécher et vit en box individuel jusqu'à vingt jours, le temps que l'infection provoquée guérisse d'elle-même, l'ensemble servant à tester des traitements vétérinaires présentés comme une réponse à l'antibiorésistance. Aucun de ces chiens n'est tué : ils rejoignent le "stock des animaux hébergés dans les locaux" de l'établissement et pourront être réutilisés dans une étude suivante après guérison complète et six semaines de repos.

Objectifs

La pyodermite canine représente l'un des motifs de consultation les plus fréquents en médecine vétérinaire. C’est une infection bactérienne cutanée généralement causée par des bactéries. Lorsque la barrière cutanée est altérée, les bactéries commensales de la peau peuvent proliférer de manière excessive, entraînant un déséquilibre bactérien et une réponse inflammatoire locale. La pyodermite peut être classée en plusieurs catégories selon la profondeur de l’infection et les couches de peau affectées (de surface, superficielle ou profonde). Les chiens atteints de pyodermite présentent une barrière cutanée altérée avec la présence de croûtes, de pustules, de papules et des zones d’alopécie. La qualité de vie de l’animal est affectée, il se gratte et se lèche, ce qui peut augmenter l’infection.Les traitements classiques actuels reposent l'utilisation de topiques antiseptiques et l'utilisation d'antibiotiques par voie systémique. Cependant, l'augmentation de l’émergence de la résistance aux antimicrobiens des bactéries limite considérablement les options thérapeutiques et le traitement de la pyodermite devient alors un défi. Ce projet s’inscrit dans une démarche de développement de nouveaux traitements vétérinaires, pharmaceutiques ou non. Il se décomposera en 2 procédures: mise en place d’un modèle expérimental de pyodermite superficielle imitant étroitement la maladie naturelle et évaluation de l’efficacité de nouveaux traitements de la pyodermite en vue d’optimiser et de réduire l’utilisation des antibiotiques lorsqu'ils s'avèrent nécessaires. Ces nouveaux traitements permettront également de limiter les conséquences de la maladie et amélioreront de façon notable le bien-être de l’animal. Le modèle de pyodermite sera mis en place d’après des modèles décrits dans la littérature. Les traitements seront testés chez l’espèce de destination et de ce fait une sélection préalable de solutions de traitement ne présentant pas de risque pour l’animal sera réalisée (excipient, volume à administrer…). Les traitements pourront être administrés par voie topique (sprays, mousses, gels, shampooings) ou par voie systémique (alternatives aux antibiotiques ou complémentaires aux antibiotiques)dans le strict respect des bonnes pratiques vétérinaires d’administration.

Bénéfices attendus

La pyodermite canine est due à la prolifération opportuniste de bactéries. Les traitements classiques actuels reposent sur l'administration d'antibiotiques systémiques et l'utilisation de topiques antiseptiques. Cependant, l'augmentation de l’émergence de la résistance aux antimicrobiens des bactéries limite considérablement les options thérapeutiques et le traitement de la pyodermite devient alors un défi. L’objectif de ce projet est de répondre à cette problématique d’antibiorésistance avec des solutions alternatives et/ou complémentaires aux traitements antibiotiques limitant ainsi leur utilisation tout en préservant l’environnement et la santé humaine. La recherche de nouveaux traitements pour un contrôle efficace et sûr de la pyodermite doit être évaluée sur l’espèce cible présentant les caractéristiques de la maladie. La mise en place et la maitrise d’un modèle de pyodermite superficielle induisant des signes cliniques similaires aux lésions cutanées observés chez les chiens souffrant de pyodermite spontanée, permettront d’évaluer l’efficacité d’un traitement dans des conditions contrôlées, d’améliorer les phases de screening de nouvelles solutions alternatives aux antibiotiques et ainsi de sélectionner plus rapidement et de façon plus sûre, des solutions présentant une probabilité importante de succès de guérison sur un nombre optimisé d’animaux. Ainsi, ces traitements permettront d’améliorer l’état et le bien-être du chien (plus de grattage, ni léchage) tout en préservant son microbiome cutané. Ces nouveaux traitements participeront à améliorer le confort d'application et d'utilisation par rapport à l'existant (spot on, durée de traitement réduit...).

Procédures

- Préparation des zones de peau à infecter, tonte et légère abrasion avec une bande adhésive (« tape stripping ») puis au dermaroller - 1x par procédure – quelques minutes - Administration du (des) traitements : • Par voie topique par spray, shampooing - 1 à plusieurs applications par semaines pendant 1 à 4 semaines selon le traitement – maximum 5 mn • Par voie générale - 1 administration unique – 1 mn - Prélèvements • Microbiologiques – 1 prélèvement/zone testée - 1 fois durant la phase d’acclimatation, à J0, les 5 jours suivants la phase d’induction, puis tous les 2 à 4 jours jusqu’à la guérison spontanée (maximum 20 jours) - 2 mn par prélèvement. • Cytologiques, – 1 prélèvement/zone testée - 1 fois durant la phase d’acclimatation, à J0, les 5 jours suivants la phase d’induction, puis tous les 2 à 4 jours jusqu’à la guérison spontanée (maximum 20 jours) - 2 mn par prélèvement.

Impact sur les animaux

1/L’induction du modèle de pyodermite, la collecte d’échantillons et les études d’efficacité pharmacologique requièrent une contention légère et de très courte durée des animaux, pouvant induire un stress léger. 2/L’induction d’une pyodermite superficielle induira des lésions cutanées attendues au niveau des zones testées (ex: érythème, papules/pustules, croûtes). Ces lésions pourront entrainer du prurit et donc être source d'inconfort pour le chien. 3/Prélèvements cytologiques: certains prélèvements pourront se faire par aspiration, c'est-à-dire via l'introduction d'une aiguille dans la lésion cutanée observée, pouvant induire une légère douleur pour l'animal au moment de la ponction. 4/Mobilité réduite: pour éviter le léchage qui pourrait aggraver les symptômes infectieux, les chiens devront porter une collerette pouvant générer un léger stress et inconfort. 5/Afin d’éviter toute contamination croisée entre les chiens (contamination de la zone inoculée par la flore buccale et/ou par les germes de différentes souches qui pourront être appliqués sur les différents chiens), ils seront hébergés en box individuel au maximum 20 jours ce qui pourra induire du stress pour l'animal. L’hébergement collectif sera privilégié pour chaque étude qui le permettra.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront réintroduits dans le stock des animaux hébergés dans les locaux de l’EU. Les études de ce projet seront conduites séquentiellement afin d’obtenir les informations scientifiques nécessaires tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Les animaux pourront être réutilisés dans chaque étude du projet après totale guérison et une période de repos de 6 semaines minimum. L’effet cumulatif est évalué par le vétérinaire de l’EU en collaboration avec le(s) directeurs(s) d’étude(s) selon le type de produits administrés. Les animaux peuvent être réutilisés après une période de repos suffisante entre 2 études pour s’assurer de l’élimination totale de l’organisme du dernier traitement administré ; cette durée ne peut être inférieure à 10 fois la demi-vie du produit si celle-ci est connue ou 1 mois si celle-ci n’est pas connue. De plus, tout animal réutilisé fait l’objet d’une visite du vétérinaire de l’EU qui certifie que l’animal a pleinement recouvré son état de santé et de bien-être général et peut être ré-inclus dans une nouvelle étude sans dommage pour lui.

Remplacement

Conformément au principe de remplacement, des modèles non animaux (cultures cellulaires, peau reconstruite, systèmes ex vivo) ont été évalués. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la physiopathologie de la pyodermite superficielle canine, reposant sur l’altération de la barrière cutanée, sa colonisation par une bactérie et la réponse immunitaire cutanée de l’hôte. Seul un modèle in vivo permettra d’analyser simultanément et de façon standardisée, l’induction des lésions, la dynamique infectieuse, l’inflammation et la cicatrisation, ainsi que l’évaluation clinique des stratégies thérapeutiques. Des études in vitro pourront être réalisées en amont de chacune des études de cette procédure, comme : - Des études de microbiologie permettront de caractériser les agents infectieux utilisés lors du modèle et de sélectionner des souches adaptées en évaluant leur pathogénicité et leur sensibilité aux solutions de traitement à évaluer. - Des études de toxicité des solutions de traitement à évaluer permettront d’écarter les produits toxiques ou mal tolérés.

Réduction

Dans la mesure du possible, des approches in vitro seront réalisées préalablement afin de sélectionner les meilleurs candidats de traitement pour un passage in vivo et limiter le nombre d’animaux inclus dans la procédure. Les études réalisées dans le cadre de ce projet seront conduites séquentiellement afin d’obtenir les informations scientifiques nécessaires tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés et en préservant leur bien-être autant que possible. Dans chaque plan d’étude, le nombre d’animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié de manière à optimiser leur utilisation et à en réduire leur nombre tout en s’assurant que ce nombre permettra d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettront de prendre une décision sur l’induction de la pyodermite et /ou le niveau d’efficacité de la/des solutions de traitement évaluées. Chaque animal sera son propre témoin. La littérature nous montre que pour ce modèle, un minimum de 6 chiens est nécessaire pour garantir des résultats exploitables. Les études de mise au point seront réalisées sur 6 à 8 chiens (dans le cas où différentes conditions devraient être étudiées, telles que l'application de germes différents). Lors des études d’évaluation de produits, 3 à 4 groupes de 6 à 8 chiens seront nécessaires (2 groupes contrôles, négatif et positif, 2 groupes traités). Les différentes études seront réalisées successivement, et les animaux pourront être réutilisés dans les études suivantes après totale guérison et une période de repos de 6 semaines minimum.

Raffinement

L’induction du modèle de pyodermite, la collecte d’échantillons et les études d’efficacité pharmacologique, requièrent une contention légère des animaux. Les animaux sont habitués à la contention et au contact des expérimentateurs en étant régulièrement manipulés. Depuis leur inclusion dans l’étude jusqu’à la dernière observation, l’état de santé général des animaux sera observé a minima 2 fois par jour pour s’assurer qu’aucune réaction non attendue est observée. Des observations locales seront également prévues a minima une fois durant la phase d’acclimatation, à J0, les 5 jours suivants la phase d’induction puis tous les 2 à 4 jours jusqu’à guérison du chien. Les examens cliniques locaux pourront cependant être plus fréquents si les besoins de l’étude le justifient, par exemple, réalisés quotidiennement tout au long de la phase expérimentale. Le personnel de l’EU en charge des observations est expérimenté et formé à reconnaitre un état de santé ou comportement anormal devant être signalé au vétérinaire de l'étude. Des points limites seront définis et précisés dans chaque plan d'étude. Si un des points limites est atteint, le chien sera immédiatement retiré de la phase expérimentale et traité. Les chiens devant être hébergés en box individuel durant la phase expérimentale (maximum 20 jours), un enrichissement compensatoire avec des jeux spécifiques (tapis de léchage) leur sera fourni. Deux à trois jours après l’induction du modèle, les chiens pourront sortir faire de l’exercice, 2 à 3 fois par semaine, en individuel et sous surveillance. Les interactions avec le personnel qualifié de l’EU seront plus fréquentes qu’en hébergement collectif. Le temps en box individuel sera ajusté à chaque étude de mise en place afin de le réduire au maximum. Il sera discuté pour chaque étude avec la SBEA. L’hébergement collectif sera privilégié pour chaque étude qui le permettra. Dès qu’un animal sera guéri, il pourra de nouveau être placé en box collectif.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. L’espèce de destination des traitements contre la pyodermite étant le chien et l’absence d’alternative à l’utilisation d’animaux justifie l’utilisation des chiens dans ce projet. Les modèles seront à mettre en place chez des chiens adultes sains avec un système immunitaire mature soit des animaux de plus de 10 mois.

10 831 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune servant à fabriquer environ 1 100 tests de diagnostic, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection de cellules de sarcome TG180, puis développe pendant quatorze jours une ascite abdominale qui lui fait prendre jusqu'à 50 % de son poids initial, avant d'être tuée pour que ce liquide soit prélevé. Le porteur compare cet état à une gestation, indique que les souris continuent à se toiletter, à se déplacer et à se nourrir, et écrit que la méthode ne demande pas d'analgésie du fait de son caractère "peu invasif". Douze références de réactifs marqués CE dépendent de cette production, et le porteur écrit que certaines ont déjà pu être produites in vitro, ce qui a divisé par deux le nombre de souris utilisées, l'arrêt complet restant conditionné au rythme des autorisations de commercialisation des nouveaux produits.

Objectifs

L’ascite de souris sarcome TG 180 est utilisée dans la production de 12 références de tests de diagnostic in vitro de pathologies humaines à forte mortalité ou graves conséquences parmi lesquelles nous retrouvons la toxoplasmose, les troubles thyroïdiens, différents cancers, l’anémie, des bilans hormonaux, des marqueurs d’allergies respiratoires… Tous les réactifs concernés sont marqués CE conformes à la directive européenne.

Bénéfices attendus

Ces tests de diagnostics sont basés sur une méthode immuno-enzymatique, reposant sur la capacité d’un anticorps à reconnaître et à se lier spécifiquement à une molécule appelée alors antigène. Ces principes immunologiques sont exploités pour révéler une molécule d’intérêt présente dans l’échantillon du patient grâce à un/des anticorps spécifique(s) présent(s) dans le réactif. Une souris permet la fabrication d’environ 1100 tests de diagnostic. L’ascite TG180 de souris est utilisée pour éliminer des réactions non-spécifiques éventuellement dues à la présence d’anticorps anti-souris dans l’échantillon du patient et pouvant amener à un faux résultat.

Procédures

Une injection sur souris vigile d’une durée 15 secondes maximum Un prélèvement sur animal préalablement euthanasié.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules à des souris de 30g, provoque la production d’ascite après 14 jours d’incubation, avec une prise de poids n’excédant pas 50% du poids initial. Cette production provoque un inconfort comparable à une gestation. Toutefois les souris continuent à se toiletter, à se déplacer, à se nourrir, à boire ou à interagir.

Devenir

L’ensemble des animaux est euthanasié en vue de prélever leur ascite. En aucun cas ce prélèvement s’effectue sur animal vigile.

Remplacement

Le redéveloppement de ces tests de diagnostic nécessite de définir les matières de substitution, sans compromis aucun sur la qualité des tests, en maintenant donc les performances des tests à leur niveau actuel. Il s’agit là d’un programme d’innovation s’étendant sur des années. La réduction de l’utilisation du nombre de souris sera donc progressive et fonction du rythme d’obtention des autorisations de commercialisation des nouveaux produits dans les pays où ils seront commercialisés.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste suivant les besoins nécessaires pour la fabrication de l’ensemble des kits dans lesquels rentrent le produit. Dans le passé un gros travail de sélection des souches, visant à sélectionner des souches les plus productives avec un niveau de qualité supérieur, a été effectué permettant d’avoir aujourd’hui une productivité optimisée et constante. Ce travail a permis, au fil du temps de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour le même volume de produit. L’ascite entre dans la composition de nombreux kits de dépistage de maladie humaine. Aujourd’hui certaines références ont pu être produites in-vitro permettant de s’affranchir de l’utilisation de ce produit. Cette avancée a permis de diviser par deux le nombre d’animaux utilisés. Les essais vont continuer dans cette voie afin de diminuer voire arrêter cette production dans le futur.

Raffinement

Les souris réceptionnées sont acclimatées à leurs nouvelles conditions d’hébergement pendant 14 jours Les animaux sont hébergés sur litière sciure. Des lanières cartons sont introduites dans chaque caisse permettant aux souris de construire un nid. Un tunnel en PVC est également placé dans les caisses permettant aux souris de se cacher. Tous ces éléments assurent l'enrichissement du milieu. Un suivi quotidien et individuel permet en cas d’apparition de signe clinique lors du protocole, l’application de points limites prédictifs adaptés afin de limiter toute souffrance animale. Cette méthode ne nécessite pas de recours à l’analgésie du fait de son caractère peu invasif. Une observation attentive des animaux n’a pas montré d’altération significative du comportement des animaux, mais plus un inconfort lié à la prise de poids du fait de la production d’un volume conséquent d’ascite, comparable à un état de gestation.

Choix des espèces

La spécificité d’espèce est requise car la fonctionnalité de ces anticorps est de neutraliser les interférences anti souris présentes dans les échantillons humains. Les animaux utilisés sont des souris de 21-39g. La spécificité d’espèce est requise car la fonctionnalité de ces anticorps est de neutraliser les interférences anti souris présentes dans les échantillons humains.