Rôles des facteurs de transcription Eomes et T-bet dans le métabolisme des lymphocytes TCD4 dans un contexte d’auto-immunité du système nerveux central

La Sclérose en Plaques (SEP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) qui représente un problème majeur de santé publique et les approches thérapeutiques utilisées aujourd’hui ne donnent pas entière satisfaction. De plus, la prévalence mondiale de cette pathologie est en perpétuelle augmentation dans les pays développés et en voie de développement. Il est donc important de comprendre la physiopathologie de cette maladie au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Eomes est une protéine qui se fixe à l’ADN et régule l’expression de nombreux gènes, en particulier dans les cellules du système immunitaire. Par ailleurs, le gène EOMES a été identifié dans des études d’association génétique chez l’Homme comme un gène de prédisposition à la SEP. Ces résultats suggèrent que les lymphocytes T CD4 exprimant Eomes – cellules du système immunitaire – pourraient jouer un rôle délétère dans la SEP. Cependant, le rôle spécifique de cette protéine dans les lymphocytes T CD4 reste mal connu. Des travaux ont permis de démontrer le rôle clef d’Eomes dans la physiopathologie de la SEP. En effet, il a été mis en évidence que la délétion d’Eomes diminue drastiquement la sévérité de la pathologie dans un modèle murin de SEP: l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). De plus, il a été démontré que les cellules qui expriment Eomes s’accumulent au niveau du SNC et présentent une survie accrue dans les tissus inflammatoires. Ainsi l’objectif de ce projet est d’analyser les rôles d’Eomes mais aussi de T-bet (une protéine de la même famille qu’Eomes) sur la sévérité de la pathologie et de déterminer les mécanismes moléculaires impliqués. Pour cela, nous utiliserons le modèle de l’EAE chez la souris comme modèle expérimental de la SEP. Le choix de ce modèle est basé sur le fait que la majorité des thérapies utilisées actuellement pour la SEP ont été découvertes à l’aide de ce modèle expérimental. De plus, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour Eomes et T-bet.

Des travaux menés par plusieurs équipes ont révélé qu’Eomes a un rôle dans le modèle murin de la SEP (EAE) et sur la SEP. En effet, une étude récente a mis en évidence que les patients atteints de forme secondaire progressive de SEP présentaient un nombre accru de cellules immunitaires exprimant Eomes dans le sang et dans le liquide céphalo-rachidien. Ce projet nous permettra donc de comprendre les mécanismes qui permettent aux cellules immunitaires exprimant Eomes (et/ou Tbet) de migrer, proliférer et survivre au sein du SNC au cours de la neuroinflammation. Ces résultats devraient ouvrir la voie pour l’élaboration de nouvelles thérapies visant à bloquer la différenciation ou les fonctions des cellules immunitaires exprimant Eomes et en particulier chez les patients souffrant de forme progressive de SEP chez lesquels une accumulation de cellules immunitairesexprimant Eomes a été démontrée.

Perfusion sous anesthésie générale profonde et à dose létale sur 540 animaux avec perte de conscience, analgésie (suppression de la douleur), suppression de tout réflexe et relaxation musculaire de l’animal. L’anesthésie est générale et profonde entre 5 et 10 minutes pour chaque animal après injection intrapéritonéale de 130 mg/kg de kétamine 1000 + 12 mg/kg de Xylazine 2%. La perfusion cardiaque se réalise en 5 minutes pour chaque animal. L’anesthésie générale et profonde à dose létale ainsi que la perfusion cardiaque sont réalisées une seule fois pour l’ensemble des animaux concernés. L’immunisation unique par voie cutanée à la base de la queue et les deux injections en IV de la toxine pertussique sont réalisées sur 720 animaux anesthésiés par inhalation de Vetflurane (2% + mélange air/oxygène) au moyen d’un masque positionné au niveau de la tête des animaux. L’immunisation et les injections de la toxine se réalisent en 10 minutes pour chaque animal.

Suite à l’induction de l’Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale active et passive (EAE) et aux transferts adoptifs, les animaux peuvent avoir une activité extrême (grattage ou léchage anormal) et peuvent présenter une nécrose ou une anomalie (écoulement, plaie) au niveau du site d’immunisation. Si c’est le cas, la plaie est nettoyée avec une solution de Bétadine de façon quotidienne. Les signes cliniques de l’EAE apparaissent entre le 6ème et 7ème jour post immunisation et sont évalués quotidiennement sur une échelle de 0 à 5 (ci-après) en fonction du handicap moteur. 0 : aucun signe ; 1 : faiblesse de la queue ; 2 : faiblesse de la queue et difficulté à se remettre sur ses pattes après retournement ; 3 : paralysie du train arrière ; 4 : paralysie du train arrière et perte de tonus du train avant ; 5 : paralysie du train arrière et avant, euthanasie.  Ces signes cliniques augmentent jusqu’au pic de la maladie (J14-15), c’est la phase aiguë de l’EAE qui corresponds au stade clinique maximum. Il y a ensuite une phase dite de régulation où le score clinique diminue pour retourner à un stade d’environ 1-2. De J20 à J30, les animaux sont pour la plupart entre un score clinique de 1 et 2. De plus, dès qu’un animal atteindra le stade clinique 3 de l’EAE, afin d’éviter une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, du Gel Diet et du Gel Water sont placés sur une petite boîte de Pétri et renouvelés quotidiennement, dans toutes les cages. En effet, des injections de glucose ou modification de l’alimentation ne peuvent pas être envisagées étant donné que le projet vise à identifier les acteurs métaboliques des lymphocytes TCD4 dans un contexte d’auto-immunité du système nerveux central.

Les souris 540 des animaux des procédures 1 à 3 sont anesthésiées puis mises à mort par exsanguination après perfusion cardiaque au PBS réalisée sous anesthésie générale profonde à dose létale afin de prélever différents organes : rate, noeuds lymphatiques, cerveau et moelle épinière dans le but de réaliser les études phénotypiques et fonctionnelles in vitro sur les cellules purifiées à partir des organes prélevés (cytometrie de flux et analyses de biologie cellulaire et moléculaire). Les souris donneuses des procédures 2 et 3 ainsi que les souris receveuses des procédures 2 et 3 dont la clinique a été suivie, sont euthanasiées par inhalation au CO2 (souris placées dans un environnement avec plus de 40% de CO2 pendant 7 min), soit 720 souris au total.

L’espèce animale Mus musculus utilisée dans ce projet offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour les molécules d’intérêt Eomes (délétion dans les lymphocytes T). Aucune autre espèce animale avec ces caractéristiques génotypiques pour ces protéines n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc…) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Le projet utilise des animaux âgés d’environ de 8 à 12 semaines correspondant à un système immunitaire fonctionnel.