Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 03/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-131764)
468 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Porteuses d’une mutation liée à l’autisme, elles sont soumises à des tests comportementaux d’apprentissage, de mémoire spatiale et de mémoire sociale, et des femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale pour injecter un marqueur fluorescent dans le cerveau des embryons. Les prélèvements se font après mise à mort, les animaux modifiés n’étant pas replacés pour éviter la dissémination de la mutation. Le porteur affirme que le développement du cortex ne peut être entièrement modélisé in vitro et exclut un modèle invertébré.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les maladies neurodéveloppementales telles que les troubles de l’autisme, l’épilepsie, certains retards mentaux ou encore déficits cognitifs (ex : la mémoire) résultent de la perturbation du développement cérébral chez l’embryon et pendant la petite enfance. De récentes études ont révélé qu’un certain nombre de mutations sont impliquées dans le développement de ce type de pathologies. Ce projet a pour but d’étudier un gène qui joue un rôle central dans le développement des terminaisons des cellules nerveuses (les axones) dans le système nerveux central. Des mutations dans ce gène sont associées à la pathologie autistique. L’absence de ce gène chez la souris entraîne des anomalies du développement cérébral et du comportement (notamment des altérations de la mémoire sociale et des défauts de mémoire spatiale à long terme). Cependant les mutations de ce gène et retrouvées chez les patients autistes n’ont jamais été étudiées chez la souris. Ce projet est divisé en 3 procédures et se déroulera sur 3 ans : -La première procédure consistera à caractériser le nouveau modèle de souris possédant la mutation du gène d’intérêt identifiée chez l’homme. Cette caractérisation reposera sur la comparaison de souris contrôles (non mutées) et de souris porteuses de la mutation liée à l’autisme par une analyse systématique de la viabilité et de la croissance des premières portées. -La seconde procédure visera à analyser le développement des neurones et la formation des circuits du cortex cérébral grâce à une technique chirurgicale sur des femelles gestantes. Cette méthode permet de marquer des neurones pour observer les conséquences de la mutation dans le cortex cérébral de la souris. -La troisième procédure aura pour but de tester les conséquences des mutations du gène étudié sur les fonctions cognitives à l’aide d’une série de tests comportementaux en regardant notamment l’apprentissage, la mémoire spatiale et la mémoire à long terme. Nous aborderons, en plus des déficits cognitifs, d’autres symptômes associés aux troubles du spectre autistique, tels que les troubles de la communication et de la mémoire sociale.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Il est important de comprendre comment les gènes, lorsqu’ils sont mutés, entraînent des maladies, pour améliorer le diagnostic et le conseil aux familles, et imaginer des pistes thérapeutiques. La création d’un nouveau modèle de souris permet de suivre quelles étapes du développement embryonnaire sont affectées et conduisent à l’installation de la maladie. Ceci ne peux pas être réalisé chez l’homme car ces mutations sont détectées après le diagnostic, quand la maladie est déclarée. Ce projet étudiera donc un nouveau modèle murin qui mime mieux la pathologie humaine et permettra 1) de valider le caractère pathologique des mutations de ce gène dans les troubles du neurodéveloppement et plus largement 2) une meilleure connaissance des causes des pathologies neurodéveloppementales.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
L’essentiel des expériences seront observationnelles afin de caractériser la lignée. Les animaux seront de plus soumis à des tests d’exploration des fonctions comportementales, non invasifs, et non douloureux, mais qui nécessiteront de manipuler régulièrement les animaux. Pour pouvoir étudier les défauts de formation des réseaux de neurones liés à la mutation génétique, les animaux subiront une chirurgie avec réveil (procédure 2). Cette procédure chirurgicale est rapide et consiste à injecter un marqueur fluorescent dans le cerveau des embryons. La chirurgie sera réalisée chez les femelles gestantes, sous anesthésie gazeuse (isoflurane) et en respectant les règles d’analgésie et d’asepsie chirurgicale. La durée de la chirurgie n’excèdera par 30 minutes et sera réalisée une seule fois.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances les plus sévères qui aient jamais été observées pour le gène d’intérêt chez la souris sont un retard de croissance, des défauts modérés de connectivité cérébrale et une perturbation de la mémoire à long terme. Dans ce projet, nous nous attendons à des manifestations moins sévères car la mutation étudiée n’abolit qu’une partie des fonctions du gène. La procédure d’élevage nécessite l’identification et la biopsie des animaux en vue de la réalisation du génotypage, selon la procédure en vigueur dans l’établissement utilisateur. Des animaux reproducteurs pourront être hébergés isolément afin d’éviter les comportements d’agression tout particulièrement suite aux accouplements. Cet isolement sera dans la mesure du possible limité dans le temps. Une procédure chirurgicale (procédure 2) implique une ouvertude de la cavité abdominale. Cette procédure est bien maîtrisée par les expérimentateurs. Elle sera réalisée sous anesthésie générale avec analgésie péri- et post-opératoire, ainsi qu’un suivi post-opératoire adapté. Dans de très rares cas, cette technique peut entraîner une difficulté à la mise bas ou une mortalité intra-utérine d’embryons.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux inclus dans ce projets sont des animaux génétiquement modifiés pour porter une mutation retrouvée chez des patients atteints de troubles autistiques. Il n’est pas envisageable de replacer les animaux à l’issue de ces procédures pour s’assurer que la mutation introduite ne dissémine pas hors du laboratoire. Par ailleurs ce projet nécessite la réalisation de prélèvements post-mortem pour atteindre ses objectifs scientifiques.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce projet a pour objectif de mieux caractériser les altérations comportementales dans un modèle murin possédant la mutation de novo d’un gène d’autisme et d’identifier des défauts dans les circuits neuronaux soulignant ces altérations cognitives. En préalable à ce projet, nous avons réalisé des expériences in vitro prouvant que la mutation étudiée altère la fonction du gène d’intérêt, ce qui nous permet de nous assurer que l’étude est pertinente. Néanmoins dans l’état actuel des connaissances scientifiques, les étapes de développement du cortex cérébral et la mise en place des circuits neuronaux ne peuvent être modélisés entièrement in vitro. L’approche in vivo est une nécessité afin d’aborder des troubles complexes de la cognition et du comportement. L’étude de circuits corticaux nécessite d’avoir recours à un animal possédant une structure corticale et par conséquent empêche le remplacement par un modèle invertébré.
2. Réduction
Les accouplements seront optimisés afin de produire strictement le nombre nécessaire d’animaux pour la caractérisation initiale du modèle (procédure 1). Une partie des animaux issus de la procédure 1 pourra être utilisés pour les tests comportementaux pour compléter les cohortes (procédure 3), nous évitant ainsi de générer de nouveaux individus. Le nombre d’animaux utilisés en procédure 3 est limité au minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats, ce qui sera analysée au moyen d’un test statistique adapté. Pour le test de sociabilité, utilisant en plus des congénères étrangers, nous aurons recours si possible à des animaux déjà présents dans l’animalerie, dans le but de ne pas commander d’animaux supplémentaires.
3. Raffinement
Les animaux étant élevés et hébergés dans une animalerie agréée, les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins seront appropriées en fonction de leur âge et de leur sexe selon les procédures en vigueur à l’animalerie dans le respect du bien-être animal. La procédure chirurgicale (procédure 2) est bien maîtrisée par les expérimentateurs et sera réalisée uniquement par un chercheur expérimenté. Un recours à l’analgésie péri-opératoire, ainsi qu’à une analgésie post-opératoire (calibrée par rapport à une grille d’évaluation de la douleur) nous permettra de limiter le stress et la douleur subis par les mères. Concernant les évaluations comportementales (procédure 3), les animaux sujets aux tests de comportement seront acclimatés à la salle de test au préalable afin de réduire le stress causé par un nouvel environnement. Les différents tests seront réalisés les uns à la suite des autres, avec un temps de pause d’au moins une semaine entre chaque test pour limiter un stress éventuel des animaux. A noter que les tests de comportement ne sont pas invasifs et ne portent pas atteinte à l’intégrité de l’animal.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales telles l’autisme et:ou les déficiences mentales. Par ailleurs, des études précédentes nous ont permis de décrire que le gène d’intérêt est associées à la pathologie autistique et que son inactivation perturbe le développement cérébral et le comportement chez la souris. Puisque ce projet vise à établir un nouveau modèle murin de trouble du neurodeveloppement/autisme, il est nécessaire de suivre les animaux depuis la naissance jusqu’à un stade adulte, afin de caractériser l’évolution des phénotypes chez la souris. Une procédure se déroulera sur des femelles gestantes car les perturbations du développement cérébral surviennent dès l’embryon.